發(fā)酵乳中細菌檢測的核心流程及常見問題與失效原因分析！
小楊 / 2025-12-16 10:07:49
百歐博偉生物：發(fā)酵乳中細菌檢測核心圍繞目標益生菌（如
乳酸菌）的定量/定性、雜菌（致病菌、腐敗菌）的篩查/鑒定展開，需遵循標準化操作流程以保證結果準確、可重復，以下是全維度的檢測體系：
一、檢測前準備
1、樣品處理
取樣原則：遵循 GB 4789 系列標準，無菌操作采集發(fā)酵乳樣品（液體/凝固型），凝固型需先無菌均質（加入無菌生理鹽水/磷酸鹽緩沖液，1:9 稀釋），液體型直接梯度稀釋（10?¹~10??）。
稀釋液要求：采用 0.85% 無菌生理鹽水或 PBS 緩沖液（pH 7.0~7.2），稀釋過程全程無菌，避免交叉污染。
2、培養(yǎng)基與耗材準備
檢測目標 核心培養(yǎng)基 培養(yǎng)基原理 耗材要求
乳酸菌（總） MRS 培養(yǎng)基（含瓊脂） 含酪蛋白胨、酵母膏、葡萄糖，適合乳酸菌厭氧/微需氧生長 無菌培養(yǎng)皿、移液管、厭氧培養(yǎng)袋/罐
雙歧桿菌 MRS-LP 培養(yǎng)基（添加鋰鹽 + 環(huán)絲氨酸） 抑制其他乳酸菌，僅雙歧桿菌生長 同上，需嚴格厭氧環(huán)境
大腸桿菌（雜菌） 伊紅美藍（EMB）培養(yǎng)基 乳糖發(fā)酵產酸，大腸桿菌菌落呈紫黑色帶金屬光澤 無菌涂布棒、恒溫培養(yǎng)箱
金黃色葡萄球菌 Baird-Parker 培養(yǎng)基 含卵黃乳液、氯化鉀，金黃色葡萄球菌形成黑色菌落 革蘭氏染色液、生化鑒定管
霉菌/酵母菌 孟加拉紅培養(yǎng)基 含氯霉素抑制細菌，霉菌/酵母形成特征菌落 無菌吸管、25℃培養(yǎng)箱
二、核心檢測流程
1、乳酸菌（發(fā)酵乳核心功能菌）檢測
（1）定量檢測（平板計數(shù)法，GB 4789.35）
梯度稀釋：取 1mL 稀釋液（選 10??、10??、10??三個稀釋度）加入無菌培養(yǎng)皿，每個稀釋度做 3 個平行。
倒平板：加入冷卻至 45~50℃的 MRS 瓊脂培養(yǎng)基，輕輕搖勻，待凝固后倒置。
培養(yǎng)條件：微需氧環(huán)境（厭氧袋 + 產氣包），37℃培養(yǎng) 48~72h（雙歧桿菌需嚴格厭氧，培養(yǎng) 72h）。
計數(shù)規(guī)則：選取菌落數(shù)在 30~300cfu 的平板計數(shù)，計算公式：總菌數(shù)（cfu/g/mL）= 菌落數(shù) × 稀釋倍數(shù) × 10（因初始稀釋為 1:10）。
（2）定性鑒定（確認菌種）
菌落形態(tài)觀察：乳酸菌在 MRS 平板上為圓形、乳白色、邊緣整齊、表面光滑的菌落。
生化鑒定：革蘭氏染色（陽性，無芽孢）、觸酶試驗（陰性）、糖發(fā)酵試驗（發(fā)酵葡萄糖、乳糖產酸不產氣）。
分子鑒定（精準分型）：提取菌落 DNA，進行 16S rRNA 基因擴增測序，對比 GenBank 數(shù)據(jù)庫確認菌種（如
保加利亞乳桿菌、
嗜熱鏈球菌）。
2、雜菌（致病菌/腐敗菌）篩查
增菌培養(yǎng)：取 10mL 樣品加入 90mL LB 增菌液，37℃培養(yǎng) 18~24h。
分離培養(yǎng)：取增菌液劃線接種 EMB 平板，37℃培養(yǎng) 24h，觀察特征菌落。
確認試驗：挑取可疑菌落進行乳糖發(fā)酵、靛基質試驗、甲基紅試驗，陽性判定為
大腸桿菌（發(fā)酵乳中不得檢出）。
增菌：取 25g 樣品加入 225mL 7.5% 氯化鈉肉湯，37℃培養(yǎng) 24h。
分離：劃線接種 Baird-Parker 平板，37℃培養(yǎng) 24~48h，觀察黑色菌落（周圍有渾濁圈）。
確認：血漿凝固酶試驗陽性（核心判定指標），發(fā)酵乳中不得檢出。
接種：取 1mL 稀釋液涂布孟加拉紅平板，25℃培養(yǎng) 5~7d。
計數(shù)：統(tǒng)計菌落數(shù)，發(fā)酵乳中霉菌/酵母限量通常≤100cfu/g（不同產品標準略有差異）。
三、質量控制要點
空白對照：每次檢測設置培養(yǎng)基空白（僅加培養(yǎng)基）、稀釋液空白（加稀釋液 + 培養(yǎng)基），確保無雜菌污染。
平行樣要求：同一稀釋度至少 3 個平行，菌落數(shù)相對偏差≤10%，否則重新檢測。
培養(yǎng)環(huán)境校準：定期校準培養(yǎng)箱溫度（誤差 ±1℃）、厭氧罐氧氣濃度（乳酸菌培養(yǎng)需 O?＜2%）。
四、常見問題及失效原因分析
1、乳酸菌計數(shù)結果偏低
原因：稀釋過程操作不當（如稀釋液溫度過高殺死菌）、培養(yǎng)環(huán)境氧濃度過高、培養(yǎng)基過期/pH 偏差（MRS 培養(yǎng)基 pH 需調至 6.2~6.4）。
解決：嚴格控制稀釋液溫度（室溫），確認厭氧袋產氣正常，培養(yǎng)基使用前校準 pH。
2、平板雜菌過多
原因：取樣/稀釋過程無菌操作不嚴格、培養(yǎng)基滅菌不徹底（高壓蒸汽滅菌需 121℃ 15min）、培養(yǎng)箱污染。
解決：操作在超凈工作臺進行，培養(yǎng)基滅菌后做無菌檢查，定期消毒培養(yǎng)箱。
3、雙歧桿菌分離失敗
原因：MRS-LP 培養(yǎng)基添加的鋰鹽/環(huán)絲氨酸濃度不當、厭氧環(huán)境不足。
解決：嚴格按配方添加抑制劑（鋰鹽 50mg/L、環(huán)絲氨酸 100mg/L），使用厭氧工作站而非僅厭氧袋。
五、前沿檢測技術（快速檢測）
qPCR 定量：針對乳酸菌特異性基因設計引物，實時熒光定量 PCR，1~2h 出結果，精準定量且可區(qū)分菌種。
流式細胞術：熒光染色后快速計數(shù)活菌（活細菌細胞膜完整，可被熒光染料標記），適合大批量樣品快速篩查。
生物傳感器：基于特異性抗體識別目標菌，通過信號放大實現(xiàn)快速定性，檢測時間＜30min，適合現(xiàn)場快速檢測。
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