大腸埃希氏菌增菌分離培養(yǎng)的質(zhì)量控制要點(diǎn)及操作流程！
小楊 / 2025-12-16 09:42:53
大腸埃希氏菌（Escherichia coli，簡(jiǎn)稱E. coli）的增菌與分離是食品、臨床、環(huán)境檢測(cè)中的核心實(shí)驗(yàn)步驟，質(zhì)量控制直接決定目標(biāo)菌的檢出率和鑒定準(zhǔn)確性，需從試劑耗材、操作流程、培養(yǎng)條件、結(jié)果判定四個(gè)核心環(huán)節(jié)嚴(yán)格把控，具體要點(diǎn)如下：
一、試劑與耗材的質(zhì)量控制
1、增菌培養(yǎng)基的質(zhì)控
常用增菌培養(yǎng)基：乳糖膽鹽培養(yǎng)基（LST）、營(yíng)養(yǎng)肉湯（NB）、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB），需驗(yàn)證培養(yǎng)基的適用性和無菌性。
適用性驗(yàn)證：接種標(biāo)準(zhǔn)菌株（如
E. coli ATCC 25922），36±1℃培養(yǎng) 18~24h，應(yīng)出現(xiàn)明顯渾濁；同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照（未接種培養(yǎng)基），無細(xì)菌生長(zhǎng)。
無菌性驗(yàn)證：每批次培養(yǎng)基滅菌后，取 10% 體積的培養(yǎng)基進(jìn)行空白培養(yǎng)，確認(rèn)無雜菌污染。
培養(yǎng)基儲(chǔ)存：需按說明書條件保存，避免陽光直射、受潮，防止成分降解（如乳糖分解、膽鹽失效）。
2、分離培養(yǎng)基的質(zhì)控
常用分離培養(yǎng)基：麥康凱瓊脂（MAC）、伊紅美藍(lán)瓊脂（EMB）、中國(guó)藍(lán)瓊脂，重點(diǎn)驗(yàn)證選擇性和鑒別性。
鑒別性驗(yàn)證：E. coli 在 MAC 上呈紅色菌落（發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸），在 EMB 上呈紫黑色帶金屬光澤的菌落，若菌落形態(tài)不符，說明培養(yǎng)基失效。
平板制備：傾注平板時(shí)厚度均勻（約 4mm），避免薄厚不均導(dǎo)致菌落形態(tài)異常；平板需在 2~8℃密封保存，保質(zhì)期內(nèi)使用。
3、耗材質(zhì)控
移液器、培養(yǎng)皿、吸管等需經(jīng)高壓滅菌，滅菌后進(jìn)行無菌檢查；移液器需定期校準(zhǔn)，確保移液體積準(zhǔn)確。
無菌采樣容器需密封完好，無破損、污染，一次性耗材需驗(yàn)證生產(chǎn)批號(hào)和有效期。
二、操作流程的質(zhì)量控制
1、樣品前處理的標(biāo)準(zhǔn)化
取樣需遵循無菌操作規(guī)范，固體樣品（如食品）需均質(zhì)處理，確保樣品均勻分散；液體樣品（如水樣）需充分搖勻后取樣。
稀釋梯度準(zhǔn)確：根據(jù)樣品污染程度選擇合適稀釋度（如 10?¹、10?²、10?³），稀釋液（生理鹽水或磷酸鹽緩沖液）需無菌，避免稀釋過程引入雜菌。
2、增菌環(huán)節(jié)的關(guān)鍵控制
接種量精準(zhǔn)：固體樣品一般稱取 25g 加入 225mL 增菌液，液體樣品取 25mL 加入 225mL 增菌液，確保1:10 的稀釋比例，避免接種量過高導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)不足或抑菌成分濃度過高。
增菌條件穩(wěn)定：嚴(yán)格控制溫度（36±1℃）和時(shí)間（18~24h），厭氧菌污染樣品需振蕩培養(yǎng)（150r/min），保證氧氣供應(yīng)以促進(jìn)E. coli 生長(zhǎng)。
對(duì)照設(shè)置：每批次實(shí)驗(yàn)需設(shè)置陽性對(duì)照（接種標(biāo)準(zhǔn)菌株
E. coli ATCC 25922）和陰性對(duì)照（僅增菌液培養(yǎng)），陽性對(duì)照應(yīng)增菌成功，陰性對(duì)照無細(xì)菌生長(zhǎng)。
3、分離涂布的質(zhì)控
增菌液涂布前需充分搖勻，取 1mL 增菌液或稀釋液均勻涂布于分離平板，避免涂布不均導(dǎo)致菌落重疊或漏檢。
涂布棒需經(jīng)灼燒滅菌并冷卻后使用，防止高溫殺死目標(biāo)菌；同一批次樣品需在同一條件下涂布，減少操作誤差。
三、培養(yǎng)條件的質(zhì)量控制
1、培養(yǎng)箱的參數(shù)校準(zhǔn)
培養(yǎng)箱溫度需定期校準(zhǔn)（每日記錄），確保實(shí)際溫度與設(shè)定溫度偏差≤±1℃；避免培養(yǎng)箱內(nèi)溫度不均，可放置溫度探頭監(jiān)測(cè)不同位置溫度。
需保證培養(yǎng)箱內(nèi)濕度適宜，防止平板干燥導(dǎo)致菌落形態(tài)異常；培養(yǎng)過程中避免頻繁開關(guān)箱門，維持溫度穩(wěn)定。
2、培養(yǎng)時(shí)間的嚴(yán)格把控
分離平板培養(yǎng)時(shí)間為 18~24h，若培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)（＞24h），可能出現(xiàn)非目標(biāo)菌過度生長(zhǎng)掩蓋E. coli 菌落，或E. coli 菌落老化導(dǎo)致形態(tài)特征消失。
四、結(jié)果判定與后續(xù)驗(yàn)證的質(zhì)控
1、菌落形態(tài)的準(zhǔn)確識(shí)別
需依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)圖譜判斷E. coli 特征菌落，排除非典型菌落（如 MAC 上的無色菌落，可能為非乳糖發(fā)酵菌）。
若菌落形態(tài)不典型，需結(jié)合革蘭氏染色（E. coli 為革蘭氏陰性短桿菌）初步篩選，避免誤判。
2、生化鑒定的質(zhì)控
挑取疑似菌落進(jìn)行生化試驗(yàn)（如乳糖發(fā)酵試驗(yàn)、靛基質(zhì)試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、V-P 試驗(yàn)、枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)）。
生化試劑需在有效期內(nèi)使用，試驗(yàn)條件（溫度、時(shí)間）需標(biāo)準(zhǔn)化；每批次生化試驗(yàn)需設(shè)置陽性和陰性對(duì)照菌株。
3、數(shù)據(jù)記錄與溯源
詳細(xì)記錄樣品信息、培養(yǎng)基批號(hào)、培養(yǎng)條件、菌落數(shù)、形態(tài)特征等，確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可溯源；異常結(jié)果（如陽性對(duì)照未生長(zhǎng)、陰性對(duì)照污染）需及時(shí)分析原因并重新實(shí)驗(yàn)。
五、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境與人員的質(zhì)控
實(shí)驗(yàn)室需分區(qū)（清潔區(qū)、操作區(qū)、培養(yǎng)區(qū)、鑒定區(qū)），避免交叉污染；定期對(duì)環(huán)境進(jìn)行消毒。
實(shí)驗(yàn)人員需經(jīng)專業(yè)培訓(xùn)，熟練掌握無菌操作和菌落識(shí)別技能，定期參加能力驗(yàn)證，確保操作一致性。
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