鴨胚成纖維細(xì)胞永生化抗原轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的具體操作步驟！
小楊 / 2025-12-13 09:43:02
百歐博偉生物：目前
鴨胚成纖維細(xì)胞永生化多通過(guò)慢病毒介導(dǎo) SV40 大 T 抗原轉(zhuǎn)染實(shí)現(xiàn)，該方法轉(zhuǎn)化效率高且細(xì)胞穩(wěn)定性好，具體操作步驟圍繞載體構(gòu)建、病毒包裝、細(xì)胞轉(zhuǎn)染篩選等核心環(huán)節(jié)展開，詳細(xì)流程如下：
前期準(zhǔn)備：原代鴨胚成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng)
選取 10 日齡左右健康鴨胚，在超凈工作臺(tái)內(nèi)無(wú)菌取出鴨胚，去除頭部、內(nèi)臟等部位，僅保留軀干組織。
用無(wú)菌剪刀將軀干剪碎成 1 - 2cm³ 的組織塊，加入少量含 5% 胎牛血清的 MEM 培養(yǎng)基，吹打分散組織塊后，用 300 目細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾去除大塊雜質(zhì)。
將過(guò)濾后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶，置于 37℃、5% CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。靜置 6h 后棄去未貼壁的細(xì)胞及上清，補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基，待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，用 0.25% 胰蛋白酶消化傳代，持續(xù)培養(yǎng)至 5 - 10 代，獲得狀態(tài)穩(wěn)定的原代鴨胚成纖維細(xì)胞備用。
核心環(huán)節(jié)一：構(gòu)建 SV40 大 T 抗原慢病毒表達(dá)載體
PCR 擴(kuò)增目的基因：以含 SV40 大 T 抗原 cDNA 序列的 sv40tsa58 質(zhì)粒為模板，依據(jù) SV40 完整基因組設(shè)計(jì)特異性引物。配置 50μl 高保真 PCR 反應(yīng)體系，包含引物混合液 1.5μl、10×PfU DNA 聚合酶反應(yīng)混合物 5μl、PfU DNA 聚合酶 0.5μl、模板 DNA 質(zhì)粒 1μl，剩余用滅菌去離子水補(bǔ)齊。反應(yīng)程序設(shè)定為 95℃預(yù)變性 2min；95℃15s、58℃30s、68℃4min，循環(huán) 36 次；最后 68℃延伸 5min，擴(kuò)增得到 SV40 大 T 抗原全長(zhǎng) cDNA 并純化產(chǎn)物。
載體重組構(gòu)建：將純化后的 PCR 產(chǎn)物通過(guò) Topo 克隆接入 pENTR™TOPO 載體，得到 pENTR - SV40T 質(zhì)粒。隨后進(jìn)行 LR 重組反應(yīng)，在 1.5ml 離心管中加入 7μl pENTR - SV40T 質(zhì)粒、1μl 目標(biāo)慢病毒載體、8μl TE 緩沖液及 2μl LR Clonase™II 酶混合物，25℃孵育 1h 后，加 1μl 蛋白酶 k 溶液終止反應(yīng)，37℃孵育 10min，最終構(gòu)建出 SV40 大 T 抗原慢病毒表達(dá)載體。
核心環(huán)節(jié)二：慢病毒包裝
選取 293FT 工程細(xì)胞作為包裝細(xì)胞，提前接種到培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞匯合度達(dá) 70% - 80% 時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
采用脂質(zhì)體 Lipofectamine™2000 介導(dǎo)，將構(gòu)建好的 SV40 大 T 抗原慢病毒表達(dá)載體，與包裝質(zhì)粒 pCMV - VSV - G 和 pSPAX2 共同轉(zhuǎn)染 293FT 細(xì)胞。
轉(zhuǎn)染后置于 37℃、5% CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48 - 72h，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，經(jīng)離心、過(guò)濾去除細(xì)胞碎片，獲得含 SV40 大 T 抗原的重組慢病毒液，可進(jìn)一步濃縮處理以提高病毒滴度。
核心環(huán)節(jié)三：慢病毒轉(zhuǎn)染原代鴨胚成纖維細(xì)胞
將前期培養(yǎng)好的原代鴨胚成纖維細(xì)胞接種到 6 孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)約 2×10?個(gè)，培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度達(dá) 50% - 60%。
去除孔內(nèi)舊培養(yǎng)基，加入適量稀釋后的重組慢病毒液，同時(shí)可添加少量聚凝胺以提高轉(zhuǎn)染效率，置于培養(yǎng)箱中孵育 6 - 10h。
孵育結(jié)束后，棄去含病毒的培養(yǎng)液，更換為新鮮的含 5% 胎牛血清的 MEM 完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng) 24 - 48h。
篩選與純化：獲得穩(wěn)定永生化細(xì)胞
當(dāng)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞匯合度接近 80% 時(shí)，按 1:5 比例傳代培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá) 50% - 70%，向培養(yǎng)基中加入博來(lái)霉素或 G418 等篩選藥物（濃度依據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定，如 G418 可設(shè) 400μg/mL）。
持續(xù)培養(yǎng)并定期更換含篩選藥物的新鮮培養(yǎng)基，去除未成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，約 1 - 2 周后可出現(xiàn)抗性細(xì)胞克隆。
采用濾紙法分離單個(gè)抗性克隆，將其接種到新的培養(yǎng)孔中擴(kuò)大培養(yǎng)。后續(xù)可通過(guò)免疫熒光檢測(cè) SV40 大 T 抗原的表達(dá)，確認(rèn)轉(zhuǎn)染成功。
永生化驗(yàn)證與凍存
進(jìn)行傳代對(duì)比實(shí)驗(yàn)，觀察細(xì)胞能否長(zhǎng)期穩(wěn)定傳代，同時(shí)與未轉(zhuǎn)染的原代細(xì)胞對(duì)比，驗(yàn)證其是否突破分裂限制；還可通過(guò)核型分析檢測(cè)細(xì)胞染色體穩(wěn)定性。
選取狀態(tài)良好的永生化細(xì)胞進(jìn)行凍存，棄去培養(yǎng)基后用 PBS 清洗 1 - 2 次，加入胰酶消化，隨后用完全培養(yǎng)基終止消化。1000rpm 離心 5min，棄上清后用含 10% DMSO 的胎牛血清重懸細(xì)胞，分裝到凍存管中，經(jīng)程序降溫盒放入 - 80℃冰箱過(guò)夜，次日轉(zhuǎn)入液氮長(zhǎng)期保存。
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