大鼠原代心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法及操作流程！
小楊 / 2025-12-17 09:31:42
大鼠原代心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞（RCMECs）的培養(yǎng)核心在于組織消化效率和細(xì)胞純化效果，常用方法可分為酶消化法和組織塊貼壁法兩大類(lèi)，兩種方法各有優(yōu)劣，適用于不同的實(shí)驗(yàn)需求。
一、酶消化法（最常用，效率高）
該方法通過(guò)蛋白酶降解心肌組織的細(xì)胞外基質(zhì)，釋放單個(gè)細(xì)胞，是獲取高產(chǎn)量 RCMECs 的首選方案，又可細(xì)分為混合酶分步消化法和膠原酶單次消化法。
混合酶分步消化法（推薦，純度高）
原理：利用中性蛋白酶分散心肌組織塊，再用膠原酶 IV 降解內(nèi)皮細(xì)胞周?chē)哪z原纖維，減少對(duì)細(xì)胞活性的損傷；結(jié)合差速貼壁去除成纖維細(xì)胞雜質(zhì)。
操作步驟
取材與預(yù)處理：無(wú)菌取 6-8 周齡大鼠心臟，PBS 沖洗去除殘血，剝離心外膜、大血管及結(jié)締組織，剪至 1 mm³ 大小的組織塊。
第一步消化（分散組織）：加入含 0.1% 中性蛋白酶的無(wú)血清 DMEM，37℃振蕩消化 15 min，棄上清（去除紅細(xì)胞及游離雜質(zhì)）。
第二步消化（釋放內(nèi)皮細(xì)胞）：加入含 0.2% 膠原酶 IV 的無(wú)血清 DMEM，37℃振蕩消化 20-30 min，期間每 5 min 輕輕吹打一次；當(dāng)組織塊變松散時(shí)，加入含 20% FBS 的培養(yǎng)基終止消化。
過(guò)濾與離心：用 200 目細(xì)胞篩過(guò)濾細(xì)胞懸液，1000 rpm 離心 5 min，棄上清，沉淀用 ECM 專(zhuān)用培養(yǎng)基重懸。
差速貼壁純化：將細(xì)胞懸液接種至普通培養(yǎng)瓶，37℃、5% CO? 培養(yǎng)箱孵育 1.5 h，此時(shí)成纖維細(xì)胞優(yōu)先貼壁，內(nèi)皮細(xì)胞仍懸浮；收集上清液，接種至明膠包被的培養(yǎng)瓶（明膠可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞貼壁）。
常規(guī)培養(yǎng)：24 h 后首次換液，去除未貼壁細(xì)胞，后續(xù)每 2-3 天換液一次，細(xì)胞匯合至 70%-80% 時(shí)可傳代（通常傳至 P3 代前使用）。
膠原酶單次消化法（簡(jiǎn)化版，適合快速獲取細(xì)胞）
原理：直接用膠原酶 I/IV 消化組織塊，操作簡(jiǎn)便，但消化時(shí)間需嚴(yán)格控制，避免過(guò)度消化導(dǎo)致細(xì)胞活性下降。
操作要點(diǎn)：組織塊剪碎后，加入含 0.3% 膠原酶 IV 的培養(yǎng)基，37℃消化 30-40 min，后續(xù)過(guò)濾、離心、純化步驟同混合酶法；該方法細(xì)胞產(chǎn)量略低，雜細(xì)胞比例稍高。
二、組織塊貼壁法（操作簡(jiǎn)單，細(xì)胞活性高）
該方法無(wú)需復(fù)雜的酶消化步驟，依賴(lài)組織塊邊緣自然遷移生長(zhǎng)出內(nèi)皮細(xì)胞，適合新手操作或少量細(xì)胞需求的實(shí)驗(yàn)。
原理：將心肌組織塊貼附于培養(yǎng)瓶壁，組織塊內(nèi)的細(xì)胞會(huì)逐漸遷移至培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，通過(guò)反復(fù)換液和刮除雜細(xì)胞克隆實(shí)現(xiàn)純化。
操作步驟
組織塊制備：大鼠心臟取材、剪碎至 0.5 mm³ 大小，用 PBS 漂洗 3 次，去除組織塊表面的紅細(xì)胞。
組織塊接種：將組織塊均勻鋪在明膠包被的培養(yǎng)瓶底，輕輕按壓使組織塊與瓶壁充分接觸，倒置培養(yǎng)瓶，加入少量 ECM 培養(yǎng)基（避免淹沒(méi)組織塊），37℃孵育 2 h。
翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)：待組織塊貼壁牢固后，緩慢翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使培養(yǎng)基淹沒(méi)組織塊，繼續(xù)培養(yǎng)。
純化與換液：72 h 后首次換液，去除未貼壁組織塊及漂浮雜質(zhì)；培養(yǎng)至第 5-7 天，若出現(xiàn)成纖維細(xì)胞克?。ㄩL(zhǎng)梭形，漩渦狀生長(zhǎng)），可用無(wú)菌細(xì)胞刮輕輕刮除，保留鋪路石狀的內(nèi)皮細(xì)胞克隆。
傳代：細(xì)胞匯合至 80% 時(shí)，用 0.25% 胰酶 - EDTA 消化傳代。
三、兩種方法的對(duì)比
方法類(lèi)型 優(yōu)勢(shì) 劣勢(shì) 適用場(chǎng)景
混合酶分步消化法 細(xì)胞產(chǎn)量高、純化速度快 操作步驟多、酶濃度需精準(zhǔn)控制 大規(guī)模實(shí)驗(yàn)、藥物篩選
膠原酶單次消化法 步驟簡(jiǎn)化、耗時(shí)短 細(xì)胞活性略低、雜細(xì)胞較多 快速預(yù)實(shí)驗(yàn)、方法摸索
組織塊貼壁法 細(xì)胞活性高、操作簡(jiǎn)單 產(chǎn)量低、培養(yǎng)周期長(zhǎng)（7-10 天） 少量細(xì)胞需求、新手操作
四、培養(yǎng)關(guān)鍵注意事項(xiàng)
明膠包被：培養(yǎng)瓶需用 0.1% 明膠溶液 37℃包被 1 h，可顯著提高內(nèi)皮細(xì)胞貼壁效率。
血清選擇：優(yōu)先使用優(yōu)質(zhì)胎牛血清（FBS），濃度建議 20%，可促進(jìn)原代內(nèi)皮細(xì)胞增殖。
純化時(shí)機(jī)：差速貼壁的孵育時(shí)間需嚴(yán)格控制在 1.5-2 h，過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞提前貼壁。
北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司的
微生物菌種查詢(xún)網(wǎng)提供微生物菌種保藏、測(cè)序、購(gòu)買(mǎi)等服務(wù),是中國(guó)微生物菌種保藏中心的服務(wù)平臺(tái)，并且是集微生物菌種、菌種,ATCC菌種、細(xì)胞、培養(yǎng)基為一體的大型微生物查詢(xún)類(lèi)網(wǎng)站，自設(shè)設(shè)備及技術(shù)的微生物菌種保藏中心！歡迎廣大客戶(hù)來(lái)詢(xún)！
下載附件
上一篇：大腸埃希氏菌增菌分離培養(yǎng)的質(zhì)量控制要點(diǎn)及操作流程！
下一篇：菌落總數(shù)測(cè)定的核心定義與檢測(cè)原理及應(yīng)用場(chǎng)景與標(biāo)準(zhǔn)解析！