大鼠原代肺動脈平滑肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法及注意事項(xiàng)！
小楊 / 2025-12-01 09:41:59
大鼠原代肺動脈平滑肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)是獲取高純度、高活性細(xì)胞的核心步驟，以下是標(biāo)準(zhǔn)化的操作流程，涵蓋原理、操作步驟、注意事項(xiàng)、常見問題及解決方法，可直接用于實(shí)驗(yàn)參考：
一、核心原理
通過機(jī)械分離結(jié)合酶消化法，解離大鼠肺動脈組織中的細(xì)胞外基質(zhì)，釋放平滑肌細(xì)胞；利用貼壁特性和差速貼壁法去除雜細(xì)胞（如內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞），最終獲得純化的 RPASMCs。
二、實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備
實(shí)驗(yàn)動物：SPF 級 SD 大鼠（8-12 周齡，體重 200-250g），雌雄均可（根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇）。
試劑：
基礎(chǔ)培養(yǎng)基：DMEM/F12（1:1）或 DMEM 高糖型；
消化液：0.1% Ⅰ 型膠原酶 + 0.25% 胰蛋白酶（無 EDTA）混合液（現(xiàn)配現(xiàn)用）；
完全培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基 + 10% 胎牛血清（FBS） + 1% 青霉素 - 鏈霉素雙抗；
其他：PBS（無鈣鎂）、75% 乙醇、臺盼藍(lán)染液、α-SMA 免疫熒光染色試劑盒。
耗材與儀器：
無菌手術(shù)器械（眼科鑷、眼科剪、顯微鑷、顯微剪）、60mm 培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、離心管；
超凈工作臺、CO?培養(yǎng)箱（37℃、5% CO?）、離心機(jī)、倒置顯微鏡。
三、詳細(xì)操作步驟
步驟 1：動物處死后處理（無菌操作）
大鼠經(jīng)頸椎脫臼法處死，75% 乙醇浸泡全身消毒 5min，轉(zhuǎn)移至超凈工作臺；
無菌剪開胸腔，暴露心肺組織，快速分離肺動脈干及肺內(nèi)分支（避開支氣管和肺實(shí)質(zhì)），放入預(yù)冷的無菌 PBS（含雙抗）中漂洗，去除血液和結(jié)締組織。
步驟 2：組織消化
用顯微剪將肺動脈組織剪切成 1mm³ 左右的小塊，轉(zhuǎn)移至 15mL 離心管；
加入 5mL 預(yù)溫（37℃）的膠原酶 - 胰蛋白酶混合消化液，37℃搖床（100rpm）消化 30-40min，期間每隔 10min 輕晃離心管；
鏡下觀察：當(dāng)組織塊邊緣模糊、有少量細(xì)胞游離時，加入等體積完全培養(yǎng)基終止消化。
步驟 3：細(xì)胞收集與接種
用 100 目細(xì)胞篩過濾消化液，去除未消化的組織塊，收集濾液至離心管；
1000rpm 離心 5min，棄上清，用 2mL 完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀；
將細(xì)胞懸液接種至 60mm 無菌培養(yǎng)皿，加入 3mL 完全培養(yǎng)基，輕輕搖勻；
放入 37℃、5% CO?培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，24h 內(nèi)不移動培養(yǎng)皿（避免影響細(xì)胞貼壁）。
步驟 4：細(xì)胞純化與傳代
差速貼壁純化：接種 24h 后，吸棄上清（去除未貼壁的內(nèi)皮細(xì)胞、紅細(xì)胞），加入新鮮完全培養(yǎng)基；48h 后再次換液，可去除大部分成纖維細(xì)胞；
首次換液后，每 2-3 天換液 1 次，待細(xì)胞融合至 80%-90% 時進(jìn)行傳代；
傳代操作：吸棄培養(yǎng)基→PBS 漂洗 2 次→加入 0.25% 胰蛋白酶（含 EDTA）消化 1-2min→鏡下見細(xì)胞收縮變圓時，加入完全培養(yǎng)基終止→吹打形成單細(xì)胞懸液→1000rpm 離心 5min→重懸后按 1:2 比例接種至新培養(yǎng)瓶。
步驟 5：細(xì)胞鑒定
傳代至第 2-3 代時，采用 α-SMA 免疫熒光染色鑒定：
細(xì)胞接種至爬片，融合至 70% 時固定、通透、封閉；
加入 α-SMA 一抗（1:200）4℃孵育過夜，熒光二抗（1:500）室溫孵育 1h；
DAPI 染核后，熒光顯微鏡觀察：細(xì)胞質(zhì)呈特異性綠色熒光，細(xì)胞核藍(lán)色，陽性率≥90% 即為合格。
四、關(guān)鍵注意事項(xiàng)
無菌操作：全程在超凈工作臺完成，手術(shù)器械需高壓滅菌，試劑需無菌過濾，避免支原體/細(xì)菌污染；
消化時間：消化不足會導(dǎo)致細(xì)胞釋放少，過度消化會損傷細(xì)胞活性，需鏡下實(shí)時觀察；
溫度控制：PBS、消化液、培養(yǎng)基均需預(yù)溫至 37℃，避免低溫刺激細(xì)胞；
動物選擇：優(yōu)先選擇幼齡大鼠（8-12 周齡），老年大鼠肺動脈組織纖維化嚴(yán)重，細(xì)胞活性低；
純化時機(jī)：首次換液必須在 24h 內(nèi)完成，否則內(nèi)皮細(xì)胞貼壁后難以去除，影響純度。
五、常見問題及解決方法
問題 原因 解決方法
細(xì)胞貼壁率低 消化過度/溫度過低 縮短消化時間至 30min 內(nèi)，所有試劑預(yù)溫 37℃
雜細(xì)胞過多 差速貼壁不及時 24h 內(nèi)首次換液，第 3 代后可采用有限稀釋法純化
細(xì)胞增殖緩慢 血清質(zhì)量差/培養(yǎng)箱參數(shù)異常 更換優(yōu)質(zhì) FBS，校準(zhǔn)培養(yǎng)箱 CO?濃度（5%）和溫度
細(xì)胞污染 無菌操作不嚴(yán)格 丟棄污染細(xì)胞，重新操作，加強(qiáng)器械/試劑滅菌
六、實(shí)驗(yàn)后處理
未使用的細(xì)胞可凍存：凍存液（完全培養(yǎng)基: DMSO=9:1），梯度降溫后放入液氮保存；
實(shí)驗(yàn)廢棄物（動物組織、離心管）按生物安全規(guī)范處理，避免污染。
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