巨噬細(xì)胞體外培養(yǎng)的核心要點(diǎn)及常見問題與解決方案！
小楊 / 2025-06-30 09:50:46
百歐博偉生物：巨噬細(xì)胞體外培養(yǎng)是免疫學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究中的關(guān)鍵技術(shù)，但因其對(duì)培養(yǎng)環(huán)境敏感且容易分化或激活，操作要求嚴(yán)格。以下是基于最新實(shí)踐總結(jié)的核心要點(diǎn)及注意事項(xiàng)：
一、巨噬細(xì)胞的類型與培養(yǎng)特性
1、原代巨噬細(xì)胞
來源：人外周血單核細(xì)胞（需用M-CSF誘導(dǎo)分化）、骨髓單核細(xì)胞、腹腔灌洗液或組織分離細(xì)胞。
特點(diǎn)：
增殖能力極弱（如人外周血巨噬細(xì)胞僅可傳1~3代）；
需添加細(xì)胞因子維持存活與功能；
易受激活狀態(tài)影響（如LPS可抑制增殖）。
2、巨噬細(xì)胞系
半貼壁/懸浮生長，倍增時(shí)間較長（48–72小時(shí)）；
對(duì)內(nèi)毒素（LPS）高度敏感，>1 ng/mL即可抑制50%增殖。
二、培養(yǎng)環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)化
1、溫度
最適溫度：37℃（人體細(xì)胞為36.5℃±0.5℃）；
耐受范圍：
≤39℃：代謝正常；
40–41℃：部分可逆損傷；
43℃：不可逆死亡。
2、氣體與濕度
CO?濃度：5% CO?維持培養(yǎng)基pH；
濕度：飽和濕度防止培養(yǎng)基蒸發(fā)。
3、培養(yǎng)基與添加劑
基礎(chǔ)培養(yǎng)基：RPMI 1640（原代）或F12K；
血清：高品質(zhì)胎牛血清（10–20%），避免內(nèi)毒素污染；
保存：含血清培養(yǎng)基4℃存放≤1個(gè)月，-20℃≤3–4個(gè)月。
三、細(xì)胞分離與原代培養(yǎng)
1、分離方法
骨髓/血液?jiǎn)魏思?xì)胞：密度梯度離心后，用40–75 μm濾器過濾提高祖細(xì)胞純度至30–40%；
誘導(dǎo)分化：?jiǎn)魏思?xì)胞以2×10? cells/mL密度接種，M-CSF處理5–7天。
2、培養(yǎng)監(jiān)測(cè)與換液
pH指示：培養(yǎng)基pH降至4.0時(shí)提示代謝旺盛，需換液；
換液頻率：每2–3天部分換液（避免全量更換導(dǎo)致細(xì)胞應(yīng)激）。
表：不同來源巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)條件比較
胞體外培養(yǎng)的核心要點(diǎn)及常見問題與解決方案！1.png)
四、關(guān)鍵注意事項(xiàng)
1、無菌操作
超凈臺(tái)紫外滅菌30–60分鐘，臺(tái)面以70%乙醇擦拭；
操作時(shí)穿戴實(shí)驗(yàn)服及手套，避免試劑交叉污染。
2、內(nèi)毒素控制
使用低內(nèi)毒素血清及耗材（LPS<0.01 EU/mL）；
NR8383細(xì)胞對(duì)LPS敏感，>1 ng/mL顯著抑制生長。
3、傳代操作
原代細(xì)胞：胰酶消化≤3分鐘，過度消化導(dǎo)致死亡；
細(xì)胞系：高密度凍存（2–3×10? cells/mL）。
4、設(shè)備維護(hù)
CO?培養(yǎng)箱：定期校準(zhǔn)CO?濃度、溫度，水盤每周更換無菌水；
超凈臺(tái)：HEPA濾膜每3000小時(shí)更換。
五、常見問題與解決方案
1、細(xì)胞不貼壁：檢查血清批次活性或培養(yǎng)瓶表面涂層（如用多聚賴氨酸）。
2、增殖緩慢：
原代細(xì)胞：確認(rèn)M-CSF活性（建議濃度20 ng/mL）；
細(xì)胞系：提高初始接種密度（>5×10? cells/cm²）。
3、污染預(yù)防：添加抗生素（如1%青霉素/鏈霉素），但避免長期使用掩蓋隱性污染。
4、形態(tài)異常：激活狀態(tài)可能致形態(tài)改變（如LPS刺激后偽足增多）。
表：巨噬細(xì)胞培養(yǎng)常見問題與對(duì)策
胞體外培養(yǎng)的核心要點(diǎn)及常見問題與解決方案！2.png)
六、總結(jié)
巨噬細(xì)胞的體外培養(yǎng)需嚴(yán)格把控?zé)o菌環(huán)境、溫度穩(wěn)定性、試劑純度三大核心。原代細(xì)胞應(yīng)盡快使用（≤3代），細(xì)胞系需注意內(nèi)毒素累積效應(yīng)。定期校準(zhǔn)設(shè)備參數(shù)（CO?、溫度）并選用適配培養(yǎng)基體系，是維持細(xì)胞功能的關(guān)鍵。對(duì)于特殊細(xì)胞，建議預(yù)篩選低內(nèi)毒素血清以保障實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性。
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