DAB染色液的典型使用方法和重要注意事項有哪些？
小楊 / 2025-06-30 09:28:08
百歐博偉生物：DAB（3,3'-二氨基聯(lián)苯胺）染色液是免疫組織化學(xué)（IHC）和免疫細胞化學(xué)（ICC）中最常用的酶底物顯色劑之一，主要用于檢測辣根過氧化物酶（HRP）標記的抗體。HRP催化DAB氧化，產(chǎn)生不溶于水和乙醇的棕褐色沉淀，從而在抗原所在位置形成可見的信號。以下是DAB染色液的典型使用方法和重要注意事項：
一、使用方法 (典型步驟，需在完成一抗和HRP標記的二抗孵育及洗滌后進行)
1、準備工作：
配制工作液：通常DAB試劑盒會提供濃縮液。嚴格按照說明書比例，用提供的緩沖液稀釋DAB濃縮液。臨用前加入過氧化氫（H?O?）啟動反應(yīng)（通常是最后一步加入，避免過早反應(yīng)失效）。例如：取1ml 稀釋緩沖液，加入1-2滴 DAB濃縮液，混勻，再加入1-2滴 H?O?溶液，充分混勻。注意：不同廠家配方和濃度不同，務(wù)必參照具體產(chǎn)品說明書操作。
個人防護：穿戴實驗服、一次性手套（建議雙層）、護目鏡。必須在通風(fēng)櫥內(nèi)操作！
材料：準備好計時器、避光容器（如鋁箔包裹）、洗滌緩沖液、終止液、復(fù)染液（如蘇木精）、梯度乙醇、封片劑等。
2、顯色反應(yīng)：
將配制好的DAB工作液滴加到組織切片或細胞爬片上，確保完全覆蓋樣本。
立即開始計時。
密切監(jiān)控顯色過程：在顯微鏡下觀察（一般推薦在5-10分鐘后開始觀察，具體時間根據(jù)信號強度和背景調(diào)整）。陽性信號應(yīng)呈現(xiàn)清晰的棕褐色至棕色。顯色時間通常在 1-10分鐘 之間，但最佳時間需要根據(jù)具體實驗條件（如抗體效價、抗原豐度）優(yōu)化確定。
關(guān)鍵：避免過度顯色！過長的顯色時間會導(dǎo)致高背景甚至非特異性染色。一旦觀察到理想的信號強度（陽性信號清晰，背景著色很淺或沒有），立即進行下一步。
3、終止反應(yīng)：
吸棄或用洗瓶沖掉DAB工作液（廢液倒入專用廢液缸）。
立即 用大量洗滌緩沖液徹底沖洗樣本數(shù)次（至少3次，每次1-2分鐘），以完全終止HRP的催化反應(yīng)。這是防止背景加深的關(guān)鍵步驟。也可短暫浸入蒸餾水中終止。
4、后續(xù)處理（可選但常規(guī)）：
復(fù)染：常用蘇木精進行細胞核復(fù)染（染色幾秒到幾分鐘），使細胞核呈藍色，與棕褐色的陽性信號形成對比。
脫水透明：依次通過梯度乙醇（如70%, 80%, 95%, 100%）脫水，再經(jīng)二甲苯（或環(huán)保透明劑）透明。
封片：用中性樹膠等封片劑封片，蓋上蓋玻片，長期保存。
二、重要注意事項
1、劇毒性與致癌性：這是最重要的注意事項！
DAB及其氧化產(chǎn)物是已知的潛在致癌物和致突變物。
操作必須全程在通風(fēng)良好的化學(xué)通風(fēng)櫥內(nèi)進行！
嚴格佩戴個人防護裝備：實驗服、雙層一次性手套（推薦丁腈手套）、護目鏡或面罩。
避免任何形式的接觸：嚴禁皮膚直接接觸DAB粉末或溶液，避免吸入粉塵或氣溶膠，嚴禁口吸移液。
廢棄物處理：所有接觸過DAB的物品（槍頭、離心管、吸頭、濾紙、手套、未用完的工作液等）必須作為有害化學(xué)廢棄物處理。倒入專用、明確標記為DAB廢液的廢液缸中，絕對不能直接倒入下水道！交由有資質(zhì)的機構(gòu)處理。工作臺面需用含氯漂白劑溶液（次氯酸鈉溶液）或?qū)Ｓ贸蹌┎潦萌ノ邸?/div>
2、避光保存：
DAB對光敏感，尤其是配制好的工作液。濃縮液應(yīng)避光保存（通常4°C或-20°C）。工作液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，配制好后盡快使用（通常在1小時內(nèi)用完），并避免長時間暴露在光線下。
3、嚴格控制顯色時間與監(jiān)控：
顯色時間是實驗成功的關(guān)鍵。 時間過短，信號弱；時間過長，背景深，特異性差。必須在顯微鏡下實時監(jiān)控顯色過程，一旦達到理想對比度（陽性信號強而背景干凈），立即終止反應(yīng)。不同組織、不同抗原、不同抗體批次的最佳顯色時間都可能不同，需要預(yù)實驗摸索。
4、優(yōu)化工作液濃度與H?O?濃度：
商品化試劑盒通常提供了推薦濃度。如果遇到背景過高或信號過弱，可以嘗試微調(diào)DAB濃度或H?O?濃度（通常范圍是0.01%-0.03%）。H?O?濃度過高易導(dǎo)致背景和非特異性著色。
5、徹底洗滌：
在加入DAB工作液之前，必須確保樣本經(jīng)過充分洗滌，去除殘留的二抗或未結(jié)合物質(zhì)，以減少非特異性結(jié)合導(dǎo)致的背景。
顯色后的終止洗滌必須充分徹底，以完全停止酶反應(yīng)。
6、防止污染：
使用專用的移液器、吸頭和容器處理DAB。避免交叉污染其他試劑或?qū)嶒瀰^(qū)域。工作區(qū)域使用后徹底清潔。
7、試劑穩(wěn)定性：
注意試劑盒各組分的保存條件和有效期。變質(zhì)的DAB溶液可能顏色加深（正常應(yīng)接近無色或淺黃色），或顯色能力下降。過期的H?O?會失效。遵循說明書要求保存。
8、背景問題：
高背景可能是由于：一抗/二抗?jié)舛冗^高、封閉不充分、內(nèi)源性過氧化物酶未完全阻斷（特別是富含血細胞的組織如脾、肝）、洗滌不充分、DAB/H?O?濃度過高、顯色時間過長、組織干燥等。需要逐一排查優(yōu)化。
9、使用合適的緩沖液：
配制DAB工作液時，務(wù)必使用試劑盒指定的或推薦的緩沖液。緩沖液的pH值和離子強度會影響顯色反應(yīng)。
10、記錄：
詳細記錄所使用的DAB批號、工作液配制方法（濃度、H?O?濃度）、顯色時間、觀察到的結(jié)果等信息，便于實驗重復(fù)和問題追溯。
三、總結(jié)：
DAB染色是IHC/ICC中非常成熟有效的顯色方法，但其劇毒性和致癌性要求操作者必須時刻保持高度警惕，嚴格遵守安全防護規(guī)程（通風(fēng)櫥、手套、護目鏡）和廢棄物處理規(guī)定。同時，精確控制顯色時間并實時監(jiān)控是獲得高信噪比結(jié)果的核心。務(wù)必仔細閱讀并遵循所用具體試劑盒的說明書進行操作和優(yōu)化。
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