菌液制備 接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上，接種生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24 小時；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，20～25℃培養(yǎng)24～48 小時，上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml 含菌數(shù)小于100CFU（菌落形成單位）的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng) 物至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，20～25℃培養(yǎng)5～7 天，加入3～5ml 含0.05％（v/v）聚山梨酯80 的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，采用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05％（v/v）聚山梨酯80 的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml 含孢子數(shù)小于100CFU 的孢子懸液。
菌懸液在室溫下放置應在2 小時內(nèi)使用，若保存在2～8℃可在24 小時內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液可保存在2～8℃，在驗證過的貯存期內(nèi)使用。
培養(yǎng)基接種 取每管裝量為12ml 的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基7 支，分別接種小于100CFU 的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌各2 支，另1 支不接種作為空白對照，培養(yǎng)3 天；取每管裝量為9ml 的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基7 支,分別接種小于100CFU 的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各2 支，另1 支不接種作為空白對照，培養(yǎng)5 天。逐日觀察結(jié)果。
結(jié)果判定 空白對照管應無菌生長，若加菌的培養(yǎng)基管均生長良好，判該培養(yǎng)基的靈敏度檢查符合規(guī)定。
稀釋液、沖洗液及其制備方法
稀釋液、沖洗液配制后應采用驗證合格的滅菌程序滅菌。
1.0.1%蛋白胨水溶液 取蛋白胨1.0g，加水1000ml，微溫溶解，濾清，調(diào)節(jié)pH 值至7.1±0.2，分裝，滅菌。
2．pH7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液 取磷酸二氫鉀3.56g，磷酸氫二鈉7.23g，氯化鈉4.30g，蛋白胨1.0g，加水1000ml，微溫溶解，濾清，分裝，滅菌。
3. 根據(jù)供試品的特性，可選用其他經(jīng)驗證過的適宜的溶液作為稀釋液、沖洗液(如0.9%無菌氯化鈉溶液)。
如需要，可在上述稀釋液或沖洗液的滅菌前或滅菌后加入表面活性劑或中和劑等。
方法適用性試驗
當進行產(chǎn)品無菌檢查法時，應進行方法適用性試驗，以確認所采用的方法適合于該產(chǎn)品的無菌檢查。若檢驗程序或產(chǎn)品發(fā)生變化可能影響檢驗結(jié)果時，應重新進行方法適用性試驗。
方法適用性試驗按“供試品的無菌檢查”的規(guī)定及下列要求進行操作。對每一試驗菌應逐一進行方法確認。
菌種及菌液制備 除大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B) 4 4102〕外，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉同培養(yǎng)基靈敏度檢查。大腸埃希菌的菌液制備同金黃色葡萄球菌。
薄膜過濾法 取每種培養(yǎng)基規(guī)定接種的供試品總量按薄膜過濾法過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入小于100CFU 的試驗菌，過濾。加硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基至濾筒內(nèi)。另取一裝有同體積培養(yǎng)基的容器，加入等量試驗菌，作為對照。置規(guī)定溫度培養(yǎng)3～5 天，各試驗菌同法操作。
直接接種法 取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基6 管，分別接入小于100CFU 的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、生孢梭菌各2 管，取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基6 管，分別接入小于100CFU 的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各2 管。其中1 管接入每支培養(yǎng)基規(guī)定的供試品接種量，另1 管作為對照，置規(guī)定的溫度培養(yǎng)3～5 天。
結(jié)果判斷 與對照管比較，如含供試品各容器中的試驗菌均生長良好，則說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計，照此檢查方法和檢查條件進行供試品的無菌檢查。 如含供試品的任一容器中的試驗菌生長微弱、緩慢或不生長，則說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下有抑菌作用，應采用增加沖洗量、增加培養(yǎng)基的用量、使用中和劑或滅活劑、更換濾膜品種等方法，消除供試品的抑菌作用，并重新進行方法適用性試驗。
方法適用性試驗也可與供試品的無菌檢查同時進行。
供試品的無菌檢查
無菌檢查法包括薄膜過濾法和直接接種法。只要供試品性質(zhì)允許，應采用薄膜過濾法。供試品無菌檢查所采用的檢查方法和檢驗條件應與方法適用性試驗確認的方法相同。
無菌試驗過程中，若需使用表面活性劑、滅活劑、中和劑等試劑，應證明其有效性，且對微生物無毒性。
檢驗數(shù)量 檢驗數(shù)量是指一次試驗所用供試品最小包裝容器的數(shù)量。除另有規(guī)定外，出廠產(chǎn)品按表1 規(guī)定；上市產(chǎn)品監(jiān)督檢驗按表2 規(guī)定。表1、表2中最少檢驗數(shù)量不包括陽性對照試驗的供試品用量。
檢驗量 是指供試品每個最小包裝接種至每份培養(yǎng)基的最小量（g 或ml）。除另有規(guī)定外,供試品檢驗量按表3 規(guī)定。若每支（瓶）供試品的裝量按規(guī)定足夠接種兩種培養(yǎng)基，則應分別接種硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基。采用薄膜過濾法時，只要供試品特性允許，應將所有容器內(nèi)的全部內(nèi)容物過濾。
陽性對照 應根據(jù)供試品特性選擇陽性對照菌：無抑菌作用及抗革蘭陽性菌為主的供試品，以金黃色葡萄球菌為對照菌；抗革蘭陰性菌為主的供試品以大腸埃希菌為對照菌；抗厭氧菌的供試品，以生孢梭菌為對照菌；抗真菌的供試品，以白色念珠菌為對照菌。陽性對照試驗的菌液制備同方法適用性試驗，加菌量小于100CFU，供試品用量同供試品無菌檢查時每份培養(yǎng)基接種的樣品量。陽性對照管培養(yǎng)48～72 小時應生長良好。
陰性對照 供試品無菌檢查時，應取相應溶劑和稀釋液、沖洗液同法操作，作為陰性對照。陰性對照不得有菌生長。