細(xì)胞實驗中PBS緩沖液的主要用途與使用方法及注意事項！
小楊 / 2025-07-07 09:30:12
百歐博偉生物：細(xì)胞實驗中PBS緩沖液的使用非常頻繁和基礎(chǔ)，正確使用是保證實驗結(jié)果可靠性的關(guān)鍵。以下是詳細(xì)的使用方法和注意事項：
一、PBS緩沖液的主要用途（在細(xì)胞實驗中）
1、清洗細(xì)胞：移除培養(yǎng)基、血清、胰酶、細(xì)胞碎片、代謝廢物或未結(jié)合的試劑（如抗體、染料）。
2、稀釋試劑：稀釋抗體、染料、酶、或其他需要維持生理pH和滲透壓的試劑用于細(xì)胞實驗。
3、配制溶液：作為基礎(chǔ)緩沖液配制其他細(xì)胞處理液或染色液。
4、短暫浸泡/平衡：在換液、消化、固定等步驟之間，保持細(xì)胞處于生理滲透壓環(huán)境中，防止細(xì)胞破裂或皺縮。
5、制備單細(xì)胞懸液：在細(xì)胞消化后，加入PBS稀釋或終止消化，并用于重懸細(xì)胞。
6、作為陰性對照：在免疫染色、流式細(xì)胞術(shù)等實驗中，替代一抗或二抗作為陰性對照。
二、PBS緩沖液的使用方法
1、解凍/預(yù)熱：
冷藏的PBS：從4°C冰箱取出后，建議在室溫下放置一段時間（或37°C水浴短暫預(yù)熱），使其接近室溫或37°C（根據(jù)實驗要求）。絕對避免將冰冷的PBS直接加到貼壁細(xì)胞上！溫度驟變會嚴(yán)重?fù)p傷甚至殺死細(xì)胞（熱/冷休克）。
冷凍的PBS：使用前在4°C冰箱緩慢解凍過夜，或室溫/37°C水浴快速解凍，解凍后需混勻（防止?jié)舛忍荻龋?。同樣注意使用前達(dá)到適宜溫度。
2、無菌操作：
在超凈臺或生物安全柜內(nèi)進(jìn)行所有涉及開放容器的操作。
打開瓶蓋前，用75%酒精噴灑或擦拭瓶身和瓶口。
傾倒時避免瓶口接觸任何非無菌物品（如培養(yǎng)皿邊緣、移液管尖）。
使用無菌移液管或移液器及無菌槍頭吸取。
3、清洗細(xì)胞：
吸棄原液：小心吸棄培養(yǎng)皿/培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基或處理液，避免吸到細(xì)胞（尤其貼壁細(xì)胞）。
加入PBS：沿側(cè)壁或中央（根據(jù)容器和細(xì)胞貼壁情況）輕柔加入適量預(yù)溫的PBS（通常覆蓋細(xì)胞層即可，例如6孔板每孔加1-2ml）。
輕柔搖晃：水平輕輕晃動培養(yǎng)皿/瓶數(shù)次，使PBS充分接觸細(xì)胞表面。
吸棄PBS：小心吸棄PBS。對于需要徹底清洗的實驗（如免疫染色），可重復(fù)此步驟2-3次。
關(guān)鍵點(diǎn)：動作要輕柔，避免液體直接沖擊細(xì)胞層，防止細(xì)胞脫落。每次清洗后盡量吸干凈殘留液體。
4、稀釋/配制試劑：根據(jù)實驗方案要求，用PBS將所需試劑稀釋到工作濃度。確保充分混勻。
5、短暫浸泡/平衡：在操作間隙（如消化后加培養(yǎng)基前），加入適量PBS覆蓋細(xì)胞，短暫放置（通常幾十秒到幾分鐘），然后吸棄。
6、重懸細(xì)胞：消化后的細(xì)胞沉淀，加入適量PBS，用移液管輕柔吹打（避免產(chǎn)生氣泡）形成單細(xì)胞懸液。
三、至關(guān)重要的注意事項
1、無菌性：
核心原則：PBS本身沒有防腐劑，極易滋生細(xì)菌。所有直接接觸細(xì)胞的PBS必須是無菌的！
購買：購買商業(yè)化的無菌PBS（瓶裝或袋裝）。
自配：若自行配制，必須使用高純度水，溶解試劑后，必須用0.22μm孔徑的濾膜進(jìn)行過濾除菌，并在無菌條件下分裝。
分裝：將大瓶PBS分裝到小無菌瓶中/管中使用，避免大瓶反復(fù)開啟增加污染風(fēng)險。
有效期：開封后或自配的PBS應(yīng)盡快使用。通常建議：
開封后置于4°C：1-2周內(nèi)使用完。
未開封（商業(yè)無菌品）：按說明書標(biāo)注的有效期。
觀察：使用前務(wù)必檢查PBS是否澄清透明、無沉淀、無渾濁、無絮狀物。如有任何異常（即使未到有效期），絕對禁止使用！立即丟棄。
標(biāo)識：清晰標(biāo)注配制/開封日期和有效期。
2、滲透壓與pH：
標(biāo)準(zhǔn)PBS：其滲透壓（約290 mOsm/kg）和pH（7.2-7.4）是模擬生理環(huán)境設(shè)計的。
避免隨意修改：除非特殊實驗要求（如特定離子濃度的研究），否則不要自行添加其他鹽類或改變濃度，這會改變滲透壓，導(dǎo)致細(xì)胞脹破或皺縮。
pH監(jiān)測：自配PBS或長期存放后使用前，建議用pH計檢測pH值，確保在7.2-7.4范圍內(nèi)（特別是用于敏感細(xì)胞或長時間接觸時）?？諝庵械腃O?溶解可能導(dǎo)致pH略微下降。
3、不含鈣鎂離子：
標(biāo)準(zhǔn)PBS：通常不含Ca²?和Mg²?（稱為DPBS或PBS (-)）。
為什么重要？鈣鎂離子是細(xì)胞間粘附和細(xì)胞與底物粘附的重要因子。在消化細(xì)胞（如用胰酶）時，必須使用無鈣鎂的PBS進(jìn)行清洗，否則殘留的鈣鎂離子會抑制胰酶活性，導(dǎo)致消化不完全。在不需要細(xì)胞粘附的步驟（如清洗掉未結(jié)合抗體）中，使用無鈣鎂PBS也更為常用。
特殊需求：如果實驗需要維持細(xì)胞粘附（如在某些處理過程中），應(yīng)使用含鈣鎂的PBS（稱為PBS (+)或CMF-PBS）。務(wù)必確認(rèn)你使用的PBS類型是否符合實驗要求！
4、溫度控制：
致命點(diǎn)：絕對禁止將冷藏（4°C）的PBS直接加到貼壁細(xì)胞上！溫度急劇變化會引起細(xì)胞膜損傷，導(dǎo)致大量細(xì)胞死亡、脫落。這是新手常犯的錯誤。
操作：使用前將PBS平衡至室溫或37°C（根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)溫度）?？蓪⑵孔游赵谑种袦?zé)?，或?7°C水浴或培養(yǎng)箱中短暫放置（注意避免污染瓶口）。接觸細(xì)胞時，PBS溫度應(yīng)接近細(xì)胞培養(yǎng)溫度。
5、輕柔操作：
加液、吸液、搖晃都要非常輕柔，避免液體產(chǎn)生湍流直接沖擊細(xì)胞層，尤其在清洗貼壁細(xì)胞時。
使用移液器吹打細(xì)胞懸液時，避免產(chǎn)生大量氣泡，氣泡破裂產(chǎn)生的剪切力會損傷細(xì)胞。
6、不能替代培養(yǎng)基：
PBS 不含有 細(xì)胞生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)（氨基酸、維生素、葡萄糖等）和生長因子。細(xì)胞不能在PBS中長期存活！PBS僅用于短時間的清洗、稀釋或平衡操作（通常幾分鐘內(nèi)完成）。操作完成后，需要及時加入含有營養(yǎng)成分的完全培養(yǎng)基或其他處理液。
7、金屬離子污染：
某些細(xì)胞類型對金屬離子非常敏感。使用高純度試劑和水配制PBS。避免使用金屬容器盛放或攪拌。
8、廢棄處理：
接觸過細(xì)胞的PBS可能含有生物活性物質(zhì)或潛在病原體，必須按照實驗室生物安全規(guī)定進(jìn)行處理，通常需要加入消毒劑浸泡消毒后再排放，或作為生物廢液收集高壓滅菌。
總結(jié)關(guān)鍵點(diǎn)口訣：
無菌是前提?。ㄙ徺I/過濾、分裝、檢查、標(biāo)識）
溫度要適宜?。▏?yán)禁冰PBS直接澆細(xì)胞！室溫/37°C預(yù)熱）
鈣鎂看需求?。ㄏ逑从脽o鈣鎂（-），維持粘附用有鈣鎂（+））
操作需輕柔?。ū苊鉀_擊細(xì)胞）
PBS非養(yǎng)料?。ǘ虝r操作，及時換液）