中國微生物菌種查詢網(wǎng)分離腫瘤干細(xì)胞的主要思路與分離成體干細(xì)胞的思路類似，包括根據(jù)特殊的表面林記分子進(jìn)行分選和SP細(xì)胞分離，其中依賴干細(xì)胞表面標(biāo)志分離的可供選擇的分選系統(tǒng)為免疫磁珠分選系統(tǒng)和熒光激活細(xì)胞分選（fluorescence-activated cell sorting, FACS）技術(shù)。
（一）免疫磁珠一AC133十腦腫瘤干細(xì)胞分選
【實驗用品】
(1) 材料 抗人AC133磁珠及MS分離柱。
(2）設(shè)備 磁性細(xì)胞分選器（MACS:)或全自動磁性細(xì)胞分選儀（AutoMACS）表面酒精消毒，提前30min放入超凈臺中紫外線消毒；一次性無菌移液管，15ml和50m1離心管等。
【試劑配制】
(1) 組織保存液的配制TC199培養(yǎng)基，l00ml；青霉素（10000U/ml), 4ml；鏈霉素(10000μg/ml)，4m1 。
用0. 22μm濾器過濾除菌。4℃保存。
(2) MACS緩沖液的配制PBS, 200m1；牛血清白蛋白，lg; EDTA-Na2, 0. 159g。
調(diào)節(jié)pH值至7.2，用0. 22μm濾器過濾除菌。4℃保存。
【實驗方案】
1．開始前準(zhǔn)備
腦腫瘤手術(shù)樣本，取材后在保存液中4℃保存，盡快進(jìn)行下一步實驗。
2．磁珠標(biāo)記
(1) 按實體腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)章節(jié)中的方法制備出腦腫瘤的單細(xì)胞懸液。
(2) 300g離心6min。
(3）磁性標(biāo)記細(xì)胞 去除上清液，拍散沉淀的細(xì)胞團(tuán)，用預(yù)冷的緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個／80μl緩沖液（少于1×107個細(xì)胞時也用80μl緩沖液重懸），每80μl細(xì)胞懸液中加入20μl抗人AC133磁珠。注意：標(biāo)記過程要快速，保持冰上操作，以防止抗體非特異性結(jié)合。
(4）輕輕混勻，4℃孵育20min。
(5）加入10倍或20倍標(biāo)記容積的緩沖液，300g離心10min。
(6）完全去除上清液。每108個細(xì)胞用500μl緩沖液重懸。
3．磁珠分離
(1) 將無菌分離柱從包裝中取出，固定在MACS磁場內(nèi)。注意分離柱的無菌。
(2) 分離柱下放一收集管。
(3) 先用500μl無氣泡的緩沖液潤洗分離柱，使其流過分離柱，但勿使其干燥，去除流出物，更換收集管，準(zhǔn)備分離。
(4）緩慢將標(biāo)記的細(xì)胞懸液加入分離柱，收集流出物，作為陰性部分。
(5) 待細(xì)胞懸液全部進(jìn)入分離柱后，立即加入緩沖液沖洗。每次用0. 5ml緩沖液洗滌分離柱，共三次。注意：每次加緩沖液的時機(jī)必須是前面的液體剛?cè)窟M(jìn)入分離柱，但柱子尚未干燥前。
(6）待液體流盡后，將分離柱移出磁場，加入lml緩沖液于分離柱內(nèi)，加壓洗脫，收集洗脫的陽性細(xì)胞。
(7) 細(xì)胞純度的檢測：用FITC標(biāo)記的AC133抗體標(biāo)記細(xì)胞，4℃孵育30min，離心洗滌兩次，用0. 5ml生理鹽水重懸，上機(jī)檢側(cè)。細(xì)胞純度可達(dá)95％一99％。
(8) 對分離獲得的腦腫瘤干細(xì)胞進(jìn)行生物學(xué)鑒定。
【注意事項】
(1) 免疫磁珠細(xì)胞分選具有快速、純度好、產(chǎn)量高、對細(xì)胞活力損傷小等優(yōu)點。
(2）磁珠標(biāo)記策略有直接標(biāo)記和Pul接標(biāo)記。間接磁性細(xì)胞標(biāo)記時，選擇未結(jié)合抗體、生物素化抗體或者熒光素標(biāo)記抗體作為一抗標(biāo)記細(xì)胞，再使用抗免疫球蛋白微珠、抗生物素或鏈霉親和素微珠、抗熒光素微珠作為二抗磁性標(biāo)記細(xì)胞。間接標(biāo)記主要適用于沒有直標(biāo)磁珠時，或?qū)嶒炐枰脦追N抗體的混合物同時分選或去除多種類型的細(xì)胞，或使用自備抗體或者配體的磁珠分選，此外間接標(biāo)記有放大作用，因此可在磁性分選抗原表達(dá)弱的目的細(xì)胞時使用。
(3）磁珠分選策略分為陽性分選和陰性分選。陽性分選策略是用免疫磁珠直接從細(xì)胞混合物中分離靶細(xì)胞的方法，適用于分選標(biāo)志明確的腫瘤干細(xì)胞。陰性分選策略是用免疫磁珠去除無關(guān)細(xì)胞，使靶細(xì)胞得以純化的方法，適用于缺乏針對目的細(xì)胞的特異性抗體，把已知的成熟細(xì)胞組分去除后，達(dá)到富集腫瘤干細(xì)胞的目的。在分選陽性比例很低的腫瘤干細(xì)胞時，還經(jīng)常聯(lián)合使用陽性分選和陰性分選，以得到高純度的腫瘤干細(xì)胞。
【實驗結(jié)果及分析】
(1) 用FITC標(biāo)記的抗AC133抗體對分選得到的細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，流式細(xì)胞鑒定陽性比例。
(2) 對分離獲得的腦腫瘤干細(xì)胞進(jìn)行生物學(xué)鑒定，以明確其是否具有普通腫瘤細(xì)胞所不具備的干細(xì)胞特征，即自我更新和分化能力。
① 一般生物學(xué)特征鑒定主要觀察腫瘤干細(xì)胞的形態(tài)，生長特征及核型分析。腫瘤干細(xì)胞的形態(tài)多為圓形，大小不一。與普通腫瘤細(xì)胞相比，腫瘤干細(xì)胞具有倍增時間較短、細(xì)胞生長密度增加、細(xì)胞核分裂指數(shù)較高，并且具有無限增殖能力、細(xì)胞侵襲能力較強(qiáng)等特征。細(xì)胞周期分析，大部分腫瘤干細(xì)胞處于G0期。
② 體外克隆形成能力或腫瘤球形成能力鑒定這是腫瘤干細(xì)胞鑒定的一個重要指標(biāo)。
a．克隆形成實驗：在克隆形成實驗中，將分選的陰性及陽性細(xì)胞分別以低濃度移植到
96孔培養(yǎng)板，每孔植入100-200個細(xì)胞，大約7d后觀察其各自克隆形成情況，由此證明分選的細(xì)胞形成克隆的能力。
b．集落形成實驗：白血病干細(xì)胞可進(jìn)行集落形成實驗，將分離的陰性及陽性細(xì)胞分別接種到合適的集落培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，一般14d后觀察集落（>20個細(xì)胞）形成數(shù)量。與普通組細(xì)胞所形成的集落相比，白血病干細(xì)胞能夠形成小的分散的集落，并且很少發(fā)生紅系細(xì)胞分化。
c. 實體瘤干細(xì)胞的腫瘤球形成實驗：實體瘤干細(xì)胞在體外培養(yǎng)時常常形成腫瘤球。將分離得到的腫瘤干細(xì)胞重懸于合適的培養(yǎng)基中，進(jìn)行倍比稀釋，并接種到96孔培養(yǎng)板，最終細(xì)胞稀釋的范圍從200-1個細(xì)胞／孔。培養(yǎng)7d后，對總的腫瘤球形成數(shù)目進(jìn)行計算，并計算比例。與分離的陰性細(xì)胞相比，腫瘤干細(xì)胞形成腫瘤球能力更強(qiáng)，得到腫瘤球的比例也越高。
③ 分化能力鑒定腫瘤干細(xì)胞的一個重要特征就是具有分化能力。
a．體外分化能力的鑒定：可對分離的腫瘤干細(xì)胞和在合適培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)一段時間后的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行干細(xì)胞相關(guān)和分化相關(guān)的分子檢測。可采用免疫組化，流式細(xì)胞儀分析以及RT-PCR的手段進(jìn)行研究。
b．體內(nèi)移植實驗：體內(nèi)實驗是對腫瘤干細(xì)胞自我更新與增殖分化能力的直接驗證。將腫瘤干細(xì)胞注射到嚴(yán)重免疫缺陷的實驗小鼠體內(nèi)（例如一次性注射100個、200個、500個、1000個細(xì)胞）觀察其體內(nèi)成瘤的情況和免疫組織化學(xué)檢測，由此推斷目的細(xì)胞形成腫瘤組織和增殖分化出不同成熟細(xì)胞的能力。腫瘤干細(xì)胞移植到NOD/SCID鼠內(nèi)，可以在受體鼠內(nèi)連續(xù)傳代，分離出的腫瘤干細(xì)胞二次移植時仍能產(chǎn)生具有異質(zhì)性癌細(xì)胞的腫瘤，并可多次重復(fù)，得到的腫瘤與原代腫瘤一致。
④ 腫瘤干細(xì)胞相關(guān)分子表達(dá)的檢測腫瘤干細(xì)胞和成體干細(xì)胞之鳳有很多的相關(guān)性，腫瘤干細(xì)胞也能檢測到與干細(xì)胞自我更新和分化相關(guān)的基因表達(dá)，已經(jīng)有報道腦腫瘤干細(xì)胞除了表達(dá)CD133，還具有Sox-2, musashi-1, Bmi-1,巢蛋白（nestin), melk, PSP,磷酸絲氨酸磷酸化酶等神經(jīng)干細(xì)胞和其他干細(xì)胞的基因特征。
（二）流式細(xì)胞儀法分選CD34+ CD38- Thy-1一的急性粒細(xì)胞白血病干細(xì)胞
【實驗用品】
(1）材料 淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll-hypaque，密度為1. 077g/ml)。
(2）設(shè)備 流式細(xì)胞分選儀，提前消毒；一次性無菌移液管，15ml和50ml離心管等。
【試劑配制】
(1）血制品保存液的配制TC199, 100ml；肝素，4000U；青霉素（10000U/ml),4m1；鏈霉素（10000pg/ml)，4m1 。
用0. 22μm濾器過濾除菌，每份5ml分裝，4℃保存，1個月內(nèi)使用。
(2）流式洗液的配制1 × HBSS, 200m1；胎牛血清，4g。
用0. 22μm濾器過濾除菌，4℃保存，1個月內(nèi)使用。
【實驗方案】
1．開始前準(zhǔn)備
(1) AML患者的外周血可在4℃保存，24h內(nèi)分離。
(2) D-Hanks液或生理鹽水，室溫。
2．實驗操作
(1) 取AML患者的外周血5m1，與5ml無菌保存液混勻，立即送實驗室分離單個核細(xì)胞。
(2）加10m1室溫D-Hanks液或生理鹽水稀釋外周血。
(3）取Ficoll-hypagμe（有成品供應(yīng)，密度為1. 077g/ml±0. 001g/ml) 3.4m1，放入15ml離心管中。
(4) 將稀釋后的外周血沿試管壁緩緩加入，使稀釋血液重疊于分層液上，稀釋的血液與分離液體積比例約為1，1-2，1。注意：一定要細(xì)心，動作要輕，避免沖散分層液面或與分層液混合而影響分離結(jié)果。
(5）用水平離心機(jī)以300g離心力，室溫離心20min 。
(6) 離心后管內(nèi)容物分為三層，上層為血漿（內(nèi)含血小板），中間層為分層液，底層為紅細(xì)胞和多核細(xì)胞。在上、中層液體界面處可見到乳白色混濁的單個細(xì)胞層，呈白膜狀。用毛細(xì)吸管輕輕插到白膜層，沿試管壁邊緣吸取界面層單個核細(xì)胞，移入50m1試管中。
(7）加入5倍以上體積D-Hanks液，混勻，200g離心10min。
(8）吸棄上清液，輕輕拍散沉淀的細(xì)胞團(tuán)，加20m1 D-Hanks液，200g離心10min 。
(9) 步驟（8)重復(fù)一次。
(10) 吸棄上清液，輕輕拍散沉淀的細(xì)胞團(tuán)，加20m1流式洗液，200g離心10min。
(11) 將細(xì)胞置于冰上，用流式洗液按106個/100μ的細(xì)胞濃度重懸。
(12) 細(xì)胞染色：加入Cy5標(biāo)記的抗人CD34抗體，PE標(biāo)記的抗人Thy-1抗體和FITC標(biāo)記的抗人CD38抗體，抗體濃度根據(jù)產(chǎn)品說明書的要求確定。
(13）冰上避光放置30min。
(14) 200g離心10min。
(15）去除上清液，輕輕拍散細(xì)胞團(tuán)，加l0.ml流式洗液，200g離心10min。
(16) 步驟(15)重復(fù)一次。
(17) 用適當(dāng)體積（106個細(xì)胞／0. 5ml)的流式洗液重懸細(xì)胞，按終濃度2μg/ml加入碘化丙錠(PI)，置于冰上，避光，待上機(jī)。
(18）流式細(xì)胞儀分選，根據(jù)PI攝取量去除死細(xì)胞后，根據(jù)熒光強(qiáng)度分選CD34+CD38- Thy-1一細(xì)胞亞群，分選出的細(xì)胞用含有50%FCS的IMDM培養(yǎng)基重懸。
(19）分析純度，通常要求在95％以上。將分選得到的細(xì)胞接種培養(yǎng)或進(jìn)行相關(guān)生物學(xué)檢測。
(20）根據(jù)分選結(jié)果CD34+ CD38-Thy一細(xì)胞比例可以得到腫瘤干細(xì)胞的比例。
(21）腫瘤干細(xì)胞分離后，需要進(jìn)行一系列的生物學(xué)鑒定，以確定分離得到的這部分細(xì)胞具有普通腫瘤細(xì)胞所不具備的自我更新和分化能力。
【注意事項】
(1)分離外周血單個核細(xì)胞吸取白膜層時，應(yīng)避免吸出過多的上清液導(dǎo)致血小板污染，或過多的分層液導(dǎo)致細(xì)胞獲得率下降。本法分離單個核細(xì)胞純度可達(dá)95%，細(xì)胞獲得率可達(dá)80％以上，得率的高低與骨髓液的稀釋、白膜層的吸取及室溫有關(guān)，室溫超過25℃時會
影響細(xì)胞獲得率。
(2)整個流式細(xì)胞分選前的細(xì)胞染色過程中，注意冰上操作，以最大限度地保持細(xì)胞活性；整個過程注意避光；若分離得到的細(xì)胞還要進(jìn)行無菌培養(yǎng)，在整個操作過程中要注意無菌。
【實驗結(jié)果及分析】
對分選獲得的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，并進(jìn)行腫瘤干細(xì)胞生物學(xué)鑒定。
（三）SP細(xì)胞的分選
SP(side population）細(xì)胞又稱為邊緣群細(xì)胞。用結(jié)合DNA的熒光染料Hoechst 33342處理細(xì)胞，利用腫瘤干細(xì)胞可將染料泵出細(xì)胞的性質(zhì)，經(jīng)過熒光活化細(xì)胞分選系統(tǒng)fluo-rescence activated cell sorting, FACS）的分析，將不被染色或低染色的腫瘤干細(xì)胞篩選出來。已經(jīng)有報道從腫瘤細(xì)胞系和實體瘤中都能分離出SP細(xì)胞，并且這群細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞的特征。以乳腺癌為例，介紹分離SP細(xì)胞的方法。
【實驗用品】
流式細(xì)胞分選儀，提前消毒；一次性無菌移液管，15m1和50m1離心管等。
【試劑配制】
(1) 1000×Hoechst 33342儲存液（5mg/ml，-20℃長期保存）。
(2) 1000×PI儲存液（2mg/ml，-20℃長期保存）。
(3）組織保存液的配制TC199培養(yǎng)基，100m1；青霉素（10000U/ml) , 4m1;鏈霉素(10000μg/ml)，4m1。
用0. 22μm濾器過濾除菌。4℃保存，1個月內(nèi)使用。
(4）流式洗液的配制1×HBSS, 200m1；胎牛血清， 4g。
用0. 22μm濾器過濾除菌，4℃保存，1個月內(nèi)使用。
【實驗方案】
1．開始前準(zhǔn)備
乳腺癌手術(shù)樣本，浸泡在樣品保存液中，分離前4℃保存，最長時間不超過24h。
2．實驗操作
(1) 按實體腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)章節(jié)的方法分離乳腺癌單細(xì)胞懸液，按1×107個／ml的細(xì)胞濃度重懸在1×HBSS中。
(2）按照5μg/ml的終濃度逐滴加入Hoechst 33342，輕輕混勻。
(3) 37℃溫箱中孵育90min 。
(4) 200g離心10min。
(5）去除上清液，輕輕拍散沉淀的細(xì)胞團(tuán)。用流式洗液重懸細(xì)胞，細(xì)胞濃度調(diào)整為106個細(xì)胞／0. 5m1。
(6) 按照2μg/ml的終濃度滴加PI染料，置于冰上，避光，待上機(jī)。
(7) 從乳腺癌組織中分離SP細(xì)胞的陽性率較低，一般在1％左右。
【注意事項】
(1) 乳腺癌手術(shù)樣本取材時要注意材料越新鮮，腫瘤干細(xì)胞分離成功的概率越大，一般樣本必須在外科手術(shù)1h之內(nèi)得到。手術(shù)或活檢切取的樣本應(yīng)盡早浸入無血清的培養(yǎng)基（用M199, RPM11640等基礎(chǔ)培養(yǎng)基均可，可適當(dāng)添加青霉素或鏈霉素，減少污染）中保鮮。此外應(yīng)注意取未經(jīng)治療和沒有壞死的標(biāo)本進(jìn)行分離為宜。
(2) 流式分選前，取出一小部分細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，觀察細(xì)胞是否仍保持單細(xì)胞，若觀察到有細(xì)胞成團(tuán)，用40μm尼龍網(wǎng)過濾，避免成團(tuán)的細(xì)胞影響流式細(xì)胞儀分選。