中國微生物菌種查詢網(wǎng)土霉素是四環(huán)素類抗生素，能特異性地與細菌核糖體30S亞基的A位結(jié)合，抑制肽鏈的增長和影響細菌蛋白質(zhì)的合成，對細菌有廣譜抑菌作用。因此其微生物限度檢查不能用平皿法，而應(yīng)采用薄膜過濾法消除其抑菌作用后再檢查。
一、材料
1.儀器：HWS-250型恒溫恒濕箱（天津蘇瑞科技開發(fā)有限公司），集菌儀（杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司），薄膜（孔徑0．22um），康氏振蕩器。
2. 試劑：玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基，MUG培養(yǎng)基，甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基等，均由中國藥品生物制品檢定所提供。
3 .菌種：陽性對照菌：金黃色葡萄球菌（驗證細菌）、白色念珠菌（驗證酵母菌、霉菌）；陰性對照：金黃色葡萄球菌（驗證大腸埃希菌）。所用菌種均由中國 藥品生物制品檢定所提供；稀釋劑及沖洗劑為pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液。
4 .樣品：土霉素片［0.25g（25萬單位）］，廠家為河南華利藥業(yè)有限責任公司，批號為07070601。
二、方法與結(jié)果
1 .細菌、霉菌、酵母菌檢查方法驗證。
2. 細菌檢測方法驗證。
試驗組：取供試品10g，加入pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液，于康氏振蕩器上振搖10分鐘，使片分散，500轉(zhuǎn)、分離心后，分離上清液作為供試液。取上述供試液10ml，加入100ml稀釋劑中，薄膜過濾，用沖洗液沖洗2次，每次100ml，第3次沖洗液中加入金黃色葡萄球菌菌懸液0.5ml，薄膜過濾，取出濾膜，面朝上貼于營養(yǎng)瓊脂平皿上，35℃培養(yǎng)48小時，計數(shù)。
菌液組：取金黃色葡萄球菌菌懸液0.5ml,直接接種于營養(yǎng)瓊脂平皿上，35℃培養(yǎng)48小時，計數(shù)。
供試品對照組：取上述供試液10ml,加入100ml稀釋劑中，薄膜過濾，用沖洗液沖洗3次，每次100ml，取出濾膜，面朝上貼于營養(yǎng)瓊脂平皿上，35℃培養(yǎng)48小時，計數(shù)。
稀釋劑對照組：取稀釋液10ml,薄膜過濾，用沖洗液沖洗2次，每次100ml,第3次沖洗液中加入0.5ml金黃色葡萄球菌菌懸液，薄膜過濾，取出濾膜，菌面朝上貼于營養(yǎng)瓊脂平皿上，35℃培養(yǎng)48小時，計數(shù)。
上述試驗連續(xù)做三次，結(jié)果如下：?
金黃色葡萄球菌計數(shù)后平均值：?
稀釋劑對照組菌數(shù)：第一次47個，第二次53個，第三次49個；?
菌液組菌數(shù)：第一次58個，第二次64個，第三次60個；?
試驗組菌數(shù)：第一次45個，第二次54個，第三次46個；?
供試品對照組菌數(shù)：第一次0個，第二次0個，第三次0個。
計算金黃色葡萄球菌回收率。
1 、稀釋劑對照組的回收率:(稀釋劑對照組的平均菌落數(shù)/菌液組的平均菌落數(shù))×100%?
第一次：47/58×100%=81.0%
第二次: 53/64×100%=82.8%?
第三次: 49/60×100%=81.7%
2 、試驗組的回收率:?
[(試驗組的平均菌落數(shù)-供試品對照組平均菌落數(shù))/菌液組平均菌落數(shù)]×100%?
第一次：（45-0）/58×100%=77.6%?
第二次:（54-0）/64×100%=84.4%?
第三次:（46-0）/60×100%=76.7%
霉菌、酵母菌檢查方法驗證。
試驗組：取供試品10g，加入pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液，于康氏振蕩器上振搖10分鐘，使片分散，500轉(zhuǎn)、分離心后，分離上清液作為供試液。取上述供試液10ml，加入100ml稀釋劑中，薄膜過濾，用沖洗液沖洗2次，每次100ml，第3次沖洗液中加入白色念珠菌菌懸液0.5ml，薄膜過濾，取出濾膜，面朝上貼于營養(yǎng)瓊脂平皿上，23℃培養(yǎng)72小時，計數(shù)。
菌液組：取白色念珠菌菌懸液0.5ml,直接接種于營養(yǎng)瓊脂平皿上，23℃培養(yǎng)72小時，計數(shù)。
供試品對照組：取上述供試液10ml,加入100ml稀釋劑中，薄膜過濾，用沖洗液沖洗3次，每次100ml，取出濾膜，面朝上貼于營養(yǎng)瓊脂平皿上，23℃培養(yǎng)72小時，計數(shù)。
稀釋劑對照組：取稀釋液10ml,薄膜過濾，用沖洗液沖洗2次，每次100ml,第三次沖洗液中加入0.5ml白色念珠菌菌懸液，薄膜過濾，取出濾膜，菌面朝上貼于營養(yǎng)瓊脂平皿上，23℃培養(yǎng)72小時，計數(shù)。
上述試驗連續(xù)做三次，結(jié)果如下：?
白色念珠菌計數(shù)后平均值：?
稀釋劑對照組菌數(shù)：第一次56個，第二次60個，第三次53個；?
菌液組菌數(shù)：第一次45個，第二次47個，第三次42個；?
試驗組菌數(shù)：第一次43個，第二次45個，第三次44個；?
供試品對照組菌數(shù)：第一次0個，第二次0個，第三次0個。
2.1.2.6 計算白色念珠菌的回收率。
2.1.2.6.1 稀釋劑對照組的回收率:
(稀釋劑對照組的平均菌落數(shù)/菌液組的平均菌落數(shù))×100%?
第一次：45/56×100%=80.4%?
第二次: 47/60×100%=78.3%?
第三次: 42/53×100%=78.2%
2.1.2.6.2 試驗組的回收率:
[(試驗組的平均菌落數(shù)-供試品對照組平均菌落數(shù))/菌液組平均菌落數(shù)]×100%?
第一次：（43-0）/56×100%=76.8%?
第二次:（45-0）/60×100%=75.0%?
第三次:（44-0）/53×100%=83.0%
2.2 大腸埃希菌檢測方法驗證。
2.2.1 試驗組：取供試品10g，加入pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液，于康氏振蕩器上振搖10分鐘，使片分散，500轉(zhuǎn)/分離心后，分離上清液作為供試液。取上述供試液10ml，加入100ml稀釋劑中，薄膜過濾，用沖洗液沖洗2次，每次100ml，第三次沖洗液中加入大腸埃希菌菌懸液0.2ml，薄膜過濾，取出濾膜，放入100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中, 35℃培養(yǎng)24小時,取0.2ml上述培養(yǎng)物加入5ml MUG培養(yǎng)基中,24小時后,加靛基質(zhì)試液5滴,液面呈現(xiàn)玫瑰紅環(huán)。
2.2.2 陰性菌對照組：照上述方法操作，第三次沖洗時沖洗液中加入2ml金黃色葡萄球菌菌液，薄膜過濾，取出濾膜加入100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，于35℃培養(yǎng)24小時，再取上述培養(yǎng)物劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基的平板上，于35℃培養(yǎng)24小時，未發(fā)現(xiàn)有金黃色葡萄球菌典型菌落。
3 討論
3.1 在細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法驗證三次平行試驗中，稀釋劑對照菌回收率均不低于70%，試驗組的菌回收率均不低于70%，照薄膜過濾法可進行土霉素片的細菌、霉菌及酵母菌的檢查。
3.2 通過大腸埃希菌檢測方法驗證，陰性對照組未檢出金黃色葡萄球菌，試驗組檢出大腸埃希菌，按薄膜過濾法可進行土霉素片的大腸埃希菌檢查。