出口食品中弓形菌的檢測標準
中國微生物菌種查詢網(wǎng) / 2018-10-09 08:53:12
中國微生物菌種查詢網(wǎng)弓形菌為變形菌門Σ-變形菌綱彎曲菌目彎曲菌科的一個新屬。呈彎曲或螺旋形桿狀，不產(chǎn)芽孢，最佳生長氧氣濃度為微量氧氣（3%-10%），正常大氣氧濃度條件下也可生長的革蘭氏陰性細菌。
本標準規(guī)定了食品中弓形菌的檢驗方法。
本標準適用于食品中布氏弓形菌、嗜低溫弓形菌和斯氏弓形菌的檢驗。
一、設備和材料
除微生物實驗室常規(guī)滅菌與培養(yǎng)設備外，其他設備與材料如下：
1 冰箱：2℃-8℃。
2 恒溫培養(yǎng)箱：25℃±1℃，30℃±1℃，36℃±1℃。
3 水浴或其他恒溫裝置：30℃±1℃，98℃。
4 微需氧培養(yǎng)裝置：提供微需氧條件（5%氧氣、10%二氧化碳和85%氮氣）。
5 電子天平：感量0.1g。
6 均質(zhì)器。
7 過濾裝置及濾膜（0.22μm，0.45μm）。
8 顯微鏡：10×~100×,有相差功能。
9 離心機:離心機大于等于20000g。
10 核酸蛋白分析儀。
11 基因擴增儀。
12 電泳儀。
13 凝膠成像分析系統(tǒng)。
二、培養(yǎng)基和試劑
除有特殊說明外，所有試驗用試劑均為分析純，實驗用水應符合GB/T 6682中一級水的要求。
1 JM肉湯
2 JM瓊脂
3 弓形菌瓊脂
4 布氏肉湯
5 布氏瓊脂
6 氧化酶試劑
7 三糖鐵瓊脂
8 Hugh-Leifson培養(yǎng)基
9 馬尿酸鈉水解試劑
10 吲哚乙酸紙片
11 Mueller Hinton血瓊脂
12 1mol/L,Tris-HCL緩沖液（pH8.0):稱取121.1gTris,溶于800ml水中，攪拌，加入濃鹽酸42ml，冷卻至室溫，用稀鹽酸準確調(diào)整pH至8.0，分裝后高壓滅菌備用。
13 0.5mol/L EDTA(pH8.0)：在800ml水中加入186.1gNa-EDTA*2H2O,在磁力攪拌器劇烈攪拌，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)濃度pH值至8.0（約20g氫氧化鈉顆粒），然后定容至1L，分裝后高壓滅菌備用。
14 DNA提取液：量取100ml1mol/L Tris-HCL,50ml0.5mol/LEDTA,稱取5.0gSDS,16.848g氯化鈉，定容至1L，分裝后高壓滅菌備用。
15 Taq乘合酶。
16 dNTP:dATP,dTTP,dCTP,dGTP。
17 10×PCR緩沖液:100 mmol/L氯化鉀，160 mmol/L硫酸鐵，20 mmol/L硫酸鎂.200 mmol/LTris-Hα(pH8.8)，1 % TritonX-100, 1 mg/mL BSA。
18 DNA Marker。
19 質(zhì)控參考菌株:布氏弓形菌ATCC 49616、嗜低溫弓形茵ATCC 43158和斯氏弓形菌ATCC51332(或共他可溯源的菌株)。
20 10×上樣緩沖液:0.25%溴酚藍，40%蔗糖。
21 瓊脂糖:電泳級。
22 溴化乙錠:10 mg/mL。
23 50×TAE電泳儲備液：稱取484 g Tris，量取114.2mL乙酸，200 mL 0.5mol/LEDTA(pH8.0),溶于蒸餾水中,定容至2 L。分裝后高壓滅菌備用。
三、樣品處理
1、 一般樣品
取25 g(或25 mL)樣品加入盛有225 mL JM肉湯的有濾網(wǎng)的均質(zhì)袋中(無濾網(wǎng)的均質(zhì)袋可使用無菌紗布過濾)，用拍擊式均質(zhì)器均質(zhì)1 min-2 min；或加入盛有225 mL JM肉湯的均質(zhì)杯中.以8 000r/min-10 000 r/min均質(zhì)1min-2 min,經(jīng)濾網(wǎng)或克菌紗布過。.將濾液進行培養(yǎng)。
2、整禽等樣品
用200 mL0.1%的蛋白胨水充分沖洗樣品的內(nèi)外部,并振蕩2min-3min,經(jīng)無菌紗布過濾至250 mL離心管中,16 000 g離心15 min后棄去上清,用10 mL0.1%蛋白胨水懸浮沉淀,吸取3mL于100 mL JM肉湯中。
3、需表面涂拭檢測的樣品
無菌棉簽涂布樣品表面(面積為50 cm2-100 cm2).將棉簽頭剪落到100 mL JM肉湯中進行培養(yǎng)。
4、 水樣
將4L的水（對于氯處理的水過濾前每升水中加人5 mL 1mol/L硫代硫酸鈉溶液)經(jīng)0.45μm.濾膜過濾,將濾膜浸沒在100 mL JM肉湯中進行培養(yǎng)。
5、 增菌
30℃土1℃培養(yǎng)44 h士4 h。必要時測定增菌液的pH值并調(diào)整至7.2士0.2。
6、 分離
增菌液劃線接種于JM瓊脂與弓形茵掠脂平板上,30℃士1℃培養(yǎng)24 h-48 ho觀察24 h培養(yǎng)與48 h培養(yǎng)的瓊脂平板上的菌落形態(tài)。弓形菌在JM瓊脂平板上形成灰色至白色、有或無紅色暈輪、圓形、宜徑約為1 mm-2 mm的菌落；弓形菌在弓形菌瓊脂上形成半透明、淺黃色、光滑、圓形、宜徑約為1 mm-2 mm的菌落。
四、 形態(tài)觀囊
挑取可疑菌落進行革蘭氏染色,鏡檢。
1、 動力觀察
挑取可疑茵落用1 mL布氏肉湯懸浮,用相羞顯微鏡觀察運動狀態(tài).
2、 氧化酶試驗
用鉑/銥接種環(huán)或玻璃棒挑取可疑菌落至氧化酶試劑潤濕的濾紙上,如果在10 s內(nèi)出現(xiàn)紫紅色、紫羅蘭或深藍色為陽性。
3、 微需氧條件下25℃生長斌驗
挑取可疑菌落,接種到哥倫比亞血瓊脂平板上,微需氧條件下25℃土1℃培養(yǎng)44 h土4 h,觀察細菌生長情況。
4、 三糖鐵(TSI)生長試驗
挑取可疑菌落,穿刺并劃線接種到TSI高層斜面.30℃土1℃墻養(yǎng)24 h-48 h，觀察細菌生長情況。弓形菌不產(chǎn)H2S，多數(shù)弓形菌產(chǎn)堿，底層和斜面均為紅色。
5、 Hugh-Leifson培養(yǎng)基穿刺生長
挑取可疑菌落,穿刺接種Hugh-Leifson培養(yǎng)基,30℃士1℃培養(yǎng)44h土4 h,弓形菌可在穿刺線周圍出現(xiàn)混濁生長.不發(fā)酵葡萄塘,培養(yǎng)基仍為藍色。
6、 馬尿酸鈉水解試驗
挑取菌落，加到盛有0.4 mL 1%馬尿酸鈉的試管中制成菌懸液?；旌暇鶆蚝笤?6℃±1℃水浴放置2 h或36℃土1℃培養(yǎng)箱中放置4 h。沿著試臂壁緩緩加人0.2 mL茚三酮溶液,不要振蕩,在36℃士1℃的水浴或培養(yǎng)箱中放宜10 min后判讀結(jié)果。若出現(xiàn)深紫色則為陽性；出現(xiàn)淡紫色或沒有顏色變化則為陰性。
7、 吲哚乙酸酯水解試驗
挑取菌落至吲哚乙酸酯紙片上,再滴加一滴滅菌水。如果吲哚乙酸酯水解，則在5 min-10min內(nèi)出現(xiàn)深藍色;若無顏色變化則沒有發(fā)生水解。
五、弓形菌檢驗程序（如圖）
