活死細胞染色實驗全攻略：手把手教你獲得完美結果！
小楊 / 2025-11-14 10:18:42
百歐博偉生物：在細胞生物學研究中，活死細胞染色是評估細胞活力的經典方法。今天，我們就來詳細解析這一實驗的全流程，幫你避開那些常見的“坑”。
一、實驗前期準備
1、操作臺準備
超凈臺紫外照射30分鐘充分滅菌后，關閉紫外燈，打開風機，通風10分鐘。隨后用酒精棉球仔細擦拭臺面，并點燃酒精燈，創(chuàng)造無菌操作環(huán)境。
2、試劑與材料檢查
試劑盒組分：
Calcein-AM（干粉或溶液）
PI溶液
PBS緩沖液（注意： 需提前解凍）
實驗耗材：
黑色/透明96孔板
移液槍（20μL與1000μL規(guī)格）
微量離心管（1.5mL）
二、實驗步驟詳解
1、細胞處理
當細胞密度達到90%時，接種于多孔板（如96孔板）。待細胞貼壁24小時后進行加藥處理，再加藥培養(yǎng)24小時。
關鍵細節(jié)：
觀察細胞生長狀態(tài)，吸棄舊培養(yǎng)基
使用預溫的PBS輕柔清洗1-2次（避免細胞脫落）
96孔板每孔接種3k-5k細胞（過密會導致細胞卷邊和假陽性）
鋪板時采用“米”字法搖勻，確保細胞分布均勻——這直接關系到后續(xù)拍攝效果
2、染色工作液配制
嚴格按照試劑盒說明配制染色工作液，注意避光，且現用現配！
以碧云天試劑盒為例：
Calcein-AM : PI : 緩沖液 = 1:1:1000
即分別加入1.5μL AM、1.5μL PI和1.5mL緩沖液
3、染色孵育
根據不同孔板加入相應體積的染色劑：
6孔板：1mL
12孔板：500μL
24孔板：250μL
96孔板：100μL
加入染色劑后，37℃避光孵育15-30分鐘。
4、洗滌與檢測
洗滌步驟：
吸棄染色液
用PBS清洗一次（減少背景干擾）
技巧：PBS沿孔壁加入，輕晃孔板，靜置1-2分鐘后吸棄
觀察檢測：
熒光顯微鏡下觀察
活細胞顯綠色（激發(fā)/發(fā)射波長：494/517 nm）
死細胞顯紅色（激發(fā)/發(fā)射波長：535/617 nm）
注意：避免長時間曝光，防止熒光淬滅
染色效果的好壞往往取決于細節(jié)處理。PBS清洗時動作要輕柔，避免細胞脫落；觀察時盡快完成，防止熒光淬滅影響結果判斷。
掌握這些關鍵步驟，你就能獲得清晰的活死細胞染色結果，為實驗提供可靠的數據支持！
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