液體石蠟保藏法的工作原理與操作流程及質(zhì)量控制與應(yīng)用！
小楊 / 2025-11-14 10:11:30
百歐博偉生物：液體石蠟保藏法是微生物菌種中長(zhǎng)期保藏的經(jīng)典方法之一，具有操作簡(jiǎn)單、成本低、適用范圍廣等特點(diǎn)，尤其適用于實(shí)驗(yàn)室常規(guī)菌種的保藏（保藏期通常 1-5 年，部分真菌可長(zhǎng)達(dá) 10 年）。其核心原理是通過(guò)液體石蠟形成物理屏障，隔絕氧氣、減少水分蒸發(fā)，從而降低微生物代謝活性，實(shí)現(xiàn)菌種的長(zhǎng)期存活。
一、核心原理
隔絕氧氣：液體石蠟（化學(xué)成分為礦物油，沸點(diǎn)≥300℃、純度≥99%）密度小于水，覆蓋在培養(yǎng)基表面形成均勻油層，阻斷微生物與空氣接觸，抑制需氧微生物的呼吸代謝；
保持水分：油層可防止培養(yǎng)基水分蒸發(fā)，維持微生物生長(zhǎng)所需的濕度環(huán)境，避免細(xì)胞因脫水死亡；
降低代謝速率：缺氧、低溫（通常 4℃或室溫避光）條件下，微生物代謝酶活性降低，營(yíng)養(yǎng)消耗減少，細(xì)胞進(jìn)入“休眠狀態(tài)”，從而延長(zhǎng)存活時(shí)間。
適用范圍
適用菌種：細(xì)菌（如
大腸桿菌、
枯草芽孢桿菌）、放線菌、酵母菌、霉菌等絕大多數(shù)微生物；
不適用情況：
嚴(yán)格厭氧菌（油層隔絕氧氣可能導(dǎo)致其過(guò)度缺氧死亡，建議采用厭氧袋或庖肉培養(yǎng)基保藏）；
需長(zhǎng)期保藏（＞5 年）或高價(jià)值菌種（建議優(yōu)先采用冷凍干燥保藏法）。
二、詳細(xì)操作流程（標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)程）
1、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備（無(wú)菌控制關(guān)鍵步驟）
（1）試劑與材料
液體石蠟：選擇化學(xué)純或分析純，需經(jīng)滅菌處理（避免引入雜菌）；
菌種：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的純培養(yǎng)物（此時(shí)細(xì)胞活性高、抗逆性強(qiáng)，保藏存活率最高）；
培養(yǎng)基：斜面培養(yǎng)基（根據(jù)菌種需求選擇，如細(xì)菌用 LB 斜面、真菌用 PDA 斜面）；
器材：試管（18mm×180mm）、接種環(huán)、酒精燈、恒溫培養(yǎng)箱、高壓蒸汽滅菌鍋、無(wú)菌移液管、冰箱（4℃）。
（2）液體石蠟滅菌
分裝：將液體石蠟倒入無(wú)菌試管中，高度約 1-2cm（避免過(guò)多導(dǎo)致后續(xù)接種困難）；
滅菌：121℃高壓蒸汽滅菌 30min（徹底殺滅油中雜菌）；
除水：滅菌后將試管傾斜放置在 60-80℃恒溫箱中烘干 2-4h（去除油層中殘留的水蒸氣，否則易導(dǎo)致菌種污染或代謝異常）；
冷卻：烘干后置于無(wú)菌操作臺(tái)冷卻至室溫，備用。
（3）斜面培養(yǎng)基制備與滅菌
按配方配制斜面培養(yǎng)基（如 LB 培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10g、酵母提取物 5g、NaCl 10g、瓊脂 15-20g、蒸餾水 1000mL，pH 7.0-7.2）；
分裝試管（每管約 5-7mL），121℃高壓蒸汽滅菌 20min；
擺斜面：滅菌后趁熱將試管傾斜，使培養(yǎng)基形成斜面（斜面長(zhǎng)度約為試管長(zhǎng)度的 1/2，底部留有一定空間），冷卻凝固后備用。
2、接種與保藏
（1）菌種接種
無(wú)菌操作：在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)，用滅菌接種環(huán)挑取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的純菌種，劃線接種于斜面培養(yǎng)基上（確保接種量適中，形成均勻菌落）；
培養(yǎng)活化：將接種后的斜面置于菌種最適溫度下培養(yǎng)（如細(xì)菌 37℃、酵母菌 28℃、霉菌 25-28℃），培養(yǎng)時(shí)間至菌落成熟（細(xì)菌 18-24h、真菌 2-5d）。
（2）加入液體石蠟
無(wú)菌操作：用無(wú)菌移液管吸取冷卻后的液體石蠟，緩慢注入成熟的菌種斜面試管中；
油層厚度：確保液體石蠟完全覆蓋斜面培養(yǎng)基表面，油層厚度約 0.5-1cm（避免培養(yǎng)基暴露在空氣中）；
密封：用無(wú)菌橡皮塞或硅膠塞密封試管（避免石蠟揮發(fā)或外界雜菌進(jìn)入），標(biāo)記菌種名稱、保藏日期、接種人等信息。
（3）保藏條件
長(zhǎng)期保藏（3-5 年）：室溫避光保存（適用于
放線菌、
霉菌，避免低溫導(dǎo)致油層凝固）。
三、質(zhì)量控制與關(guān)鍵注意事項(xiàng)（提高保藏成功率）
1、無(wú)菌控制（核心中的核心）
所有器材（試管、接種環(huán)、移液管）需徹底滅菌，操作全程在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，避免雜菌污染；
液體石蠟滅菌后需烘干除水，否則殘留水分會(huì)成為雜菌滋生的培養(yǎng)基，導(dǎo)致菌種污染。
2、菌種質(zhì)量控制
保藏前需確保菌種為純培養(yǎng)物（可通過(guò)平板劃線分離或顯微鏡觀察確認(rèn)，無(wú)雜菌污染）；
選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌種保藏，此時(shí)細(xì)胞活性高、抗逆性強(qiáng)，避免使用衰老期菌種（存活率低）。
3、操作細(xì)節(jié)控制
液體石蠟油層需完全覆蓋斜面培養(yǎng)基，不可留有空隙，否則空氣進(jìn)入會(huì)導(dǎo)致微生物代謝活躍，縮短保藏期；
密封試管時(shí)需確保嚴(yán)密，避免石蠟揮發(fā)或外界空氣進(jìn)入，同時(shí)防止石蠟滲漏。
4、保藏期間的質(zhì)量監(jiān)控
定期復(fù)核：保藏后每 6-12 個(gè)月進(jìn)行一次復(fù)蘇復(fù)核，檢查菌種的存活率、純度和生物學(xué)特性（如菌落形態(tài)、生理生化特征）是否穩(wěn)定；
復(fù)蘇方法：用無(wú)菌接種環(huán)挑取少量菌種（避開液體石蠟），接種到新鮮斜面培養(yǎng)基上，在最適溫度下培養(yǎng)，觀察菌落生長(zhǎng)情況。
5、異常情況處理
污染：若復(fù)蘇后發(fā)現(xiàn)雜菌，需立即進(jìn)行純分離（平板劃線或稀釋涂布），獲得純菌種后重新保藏；
存活率低：若復(fù)蘇后菌種生長(zhǎng)緩慢或不生長(zhǎng)，可能是保藏時(shí)菌種活性差、油層未完全覆蓋或保藏溫度不當(dāng)，需優(yōu)化接種菌種的生長(zhǎng)階段、調(diào)整油層厚度或更換保藏溫度。
四、菌種復(fù)蘇與復(fù)壯
1、復(fù)蘇步驟
無(wú)菌操作：打開密封的保藏試管，用滅菌接種環(huán)輕輕挑取斜面培養(yǎng)基表面的菌種（避免挑取液體石蠟，否則會(huì)影響復(fù)蘇生長(zhǎng)）；
接種培養(yǎng)：將挑取的菌種接種到新鮮斜面培養(yǎng)基上，在最適溫度下培養(yǎng)至菌落成熟；
純度驗(yàn)證：復(fù)蘇后通過(guò)平板劃線分離或顯微鏡觀察，確認(rèn)菌種純度，無(wú)雜菌污染后再用于實(shí)驗(yàn)或傳代保藏。
2、復(fù)壯方法
若復(fù)蘇后的菌種生物學(xué)特性發(fā)生變化（如產(chǎn)酶能力下降、菌落形態(tài)異常），需進(jìn)行復(fù)壯：
連續(xù)傳代：將菌種在新鮮培養(yǎng)基上連續(xù)傳代 2-3 次，恢復(fù)其正常代謝活性；
選擇培養(yǎng)：通過(guò)篩選培養(yǎng)基（如高產(chǎn)菌株的篩選培養(yǎng)基）分離優(yōu)勢(shì)菌株，恢復(fù)其原有功能；
優(yōu)化培養(yǎng)條件：調(diào)整培養(yǎng)基配方、培養(yǎng)溫度、pH 等，促進(jìn)菌種功能恢復(fù)。
五、優(yōu)缺點(diǎn)與應(yīng)用場(chǎng)景
1、優(yōu)點(diǎn)
操作簡(jiǎn)單：無(wú)需復(fù)雜設(shè)備（如冷凍干燥機(jī)、超低溫冰箱），實(shí)驗(yàn)室常規(guī)條件即可實(shí)現(xiàn)；
成本低廉：液體石蠟、斜面培養(yǎng)基等試劑成本低，適合大規(guī)模菌種保藏；
適用范圍廣：可用于細(xì)菌、放線菌、酵母菌、霉菌等絕大多數(shù)微生物；
復(fù)蘇方便：直接挑取菌種接種即可復(fù)蘇，無(wú)需復(fù)雜處理。
2、缺點(diǎn)
保藏期有限：通常 1-5 年，不及冷凍干燥法（10 年以上）；
占用空間大：試管保藏需占用較多冰箱或儲(chǔ)存空間；
部分菌種不適用：嚴(yán)格厭氧菌、對(duì)礦物油敏感的微生物無(wú)法使用；
可能影響菌種特性：長(zhǎng)期保藏可能導(dǎo)致部分菌種的代謝功能或遺傳特性發(fā)生輕微變化。
3、應(yīng)用場(chǎng)景
實(shí)驗(yàn)室常規(guī)菌種保藏（如教學(xué)實(shí)驗(yàn)用菌種、科研常用菌株）；
工業(yè)生產(chǎn)中短期使用的菌種保藏（如發(fā)酵生產(chǎn)用細(xì)菌、酵母菌）；
菌種資源庫(kù)的初步保藏（為冷凍干燥保藏提供備份）。
六、與其他保藏方法的對(duì)比
保藏方法 保藏期 操作難度 成本 適用范圍
液體石蠟保藏法 1-5 年 簡(jiǎn)單 低 細(xì)菌、放線菌、酵母菌、霉菌
冷凍干燥保藏法 10 年以上 復(fù)雜 高 絕大多數(shù)微生物（包括病毒）
超低溫冷凍保藏法（-80℃/-196℃） 5-10 年 中等 中高 動(dòng)物細(xì)胞、微生物、植物細(xì)胞
斜面?zhèn)鞔２胤?nbsp; 1-3 個(gè)月 極簡(jiǎn)單 極低 臨時(shí)保藏、菌種活化
通過(guò)以上標(biāo)準(zhǔn)化操作和質(zhì)量控制，液體石蠟保藏法可有效實(shí)現(xiàn)微生物菌種的中長(zhǎng)期穩(wěn)定保藏，滿足實(shí)驗(yàn)室科研、教學(xué)及工業(yè)生產(chǎn)的常規(guī)需求。若需長(zhǎng)期保藏高價(jià)值菌種，建議結(jié)合冷凍干燥保藏法進(jìn)行雙重保藏，確保菌種資源的安全性和穩(wěn)定性。
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