真菌培養(yǎng)過(guò)程中避免污染是確保實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵！
小楊 / 2025-07-21 09:40:12
百歐博偉生物：在真菌培養(yǎng)過(guò)程中避免污染是確保實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。污染可能來(lái)自細(xì)菌、其他真菌、病毒，甚至是培養(yǎng)物自身的交叉污染。以下是一套系統(tǒng)性的預(yù)防措施，涵蓋從實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備到后續(xù)維護(hù)的各個(gè)環(huán)節(jié)：
一、嚴(yán)格的無(wú)菌操作技術(shù) (核心關(guān)鍵)
1、工作區(qū)域準(zhǔn)備:
超凈工作臺(tái)/生物安全柜: 這是最重要的設(shè)備。使用前提前開啟紫外燈滅菌至少20-30分鐘，然后開啟風(fēng)機(jī)運(yùn)行10-15分鐘，形成穩(wěn)定的無(wú)菌氣流屏障（層流）。操作前用70%乙醇徹底擦拭臺(tái)面。
酒精燈: 在超凈臺(tái)內(nèi)點(diǎn)燃酒精燈，在其附近（火焰上方或側(cè)后方氣流最穩(wěn)定區(qū)域）進(jìn)行操作?；鹧娈a(chǎn)生的上升熱氣流有助于驅(qū)散周圍空氣中的污染物，并為金屬器械（接種環(huán)、鑷子、剪刀等）提供即時(shí)滅菌的條件。
環(huán)境清潔: 保持整個(gè)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境清潔，定期消毒（如使用紫外燈照射、消毒劑擦拭）。減少人員在操作區(qū)域不必要的走動(dòng)。
2、個(gè)人衛(wèi)生與防護(hù):
實(shí)驗(yàn)服: 穿著干凈、專用的實(shí)驗(yàn)服，最好在進(jìn)入無(wú)菌操作區(qū)前穿戴。
手套: 佩戴一次性無(wú)菌手套。操作前用70%乙醇噴灑手套表面并搓揉消毒。如有接觸非無(wú)菌物品或懷疑污染，立即更換。
口罩: 佩戴醫(yī)用口罩，防止說(shuō)話或呼吸時(shí)產(chǎn)生的飛沫污染。
頭套/帽子: 長(zhǎng)發(fā)需束起并戴頭套/帽子。
手部消毒: 進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室和開始操作前，務(wù)必用肥皂和水徹底洗手，然后用70%乙醇或免洗消毒液消毒。
3、無(wú)菌操作要點(diǎn):
快速操作: 盡量減少培養(yǎng)皿、試管開口暴露在空氣中的時(shí)間。
角度控制: 打開培養(yǎng)皿蓋或試管塞時(shí)，保持開口與水平面夾角盡量小（45度左右），避免垂直向上暴露。
火焰滅菌: 所有需要進(jìn)入無(wú)菌區(qū)的金屬器械（接種環(huán)、鑷子、針等）必須在酒精燈外焰上徹底燒紅滅菌，并在空氣中冷卻幾秒后再接觸菌種或培養(yǎng)基。每次接觸可能污染源后（如操作臺(tái)、手套、非無(wú)菌物體），都需要重新火焰滅菌。
避免交叉: 避免手或未滅菌物品越過(guò)無(wú)菌開口上方。
“無(wú)菌區(qū)”概念: 在超凈臺(tái)內(nèi)，將酒精燈周圍、靠近高效濾網(wǎng)下方的區(qū)域視為“無(wú)菌核心區(qū)”，關(guān)鍵操作（如開蓋、接種）盡量在此區(qū)域內(nèi)完成。
二、培養(yǎng)基與器皿的滅菌
1、徹底滅菌:
高壓蒸汽滅菌: 培養(yǎng)基、蒸餾水、玻璃器皿（培養(yǎng)皿、試管、移液管等）、耐熱塑料器皿等，必須使用高壓滅菌鍋在121°C, 15 psi (約1.05 kg/cm²) 下滅菌至少15-30分鐘（具體時(shí)間根據(jù)物品體積和裝載量調(diào)整，確保中心達(dá)到溫度）。使用滅菌指示膠帶或化學(xué)指示劑確認(rèn)滅菌效果。
干熱滅菌: 玻璃器皿、金屬器械也可用烘箱在160-180°C下滅菌2小時(shí)。
過(guò)濾除菌: 對(duì)熱不穩(wěn)定的溶液（如某些抗生素、維生素、激素），需使用孔徑≤0.22 µm的濾膜過(guò)濾除菌。
2、滅菌后處理:
烘干: 滅菌后的玻璃器皿（如培養(yǎng)皿、試管）應(yīng)烘干或在烘箱中稍加熱去除冷凝水，潮濕環(huán)境易滋生雜菌。
無(wú)菌保存: 滅菌后的培養(yǎng)基和器皿應(yīng)在無(wú)菌條件下（如超凈臺(tái)內(nèi)）分裝或封裝，并儲(chǔ)存在清潔、干燥的地方，避免二次污染。培養(yǎng)皿可用封口膜或裝入無(wú)菌袋密封。
預(yù)倒平板: 倒好的平板應(yīng)凝固后倒置存放，并盡快使用。避免長(zhǎng)時(shí)間存放，尤其是富含營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)基。
三、材料與試劑的純凈
來(lái)源可靠: 使用高質(zhì)量、純凈的化學(xué)試劑和蒸餾水/去離子水配制培養(yǎng)基。
無(wú)菌水: 沖洗菌體或進(jìn)行稀釋時(shí)，必須使用滅菌的蒸餾水或生理鹽水。
菌種純化: 初始菌種應(yīng)確保純凈無(wú)污染。對(duì)新獲得的菌種或長(zhǎng)期保存的菌種，在正式實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行平板劃線或稀釋涂布，挑取單菌落進(jìn)行純培養(yǎng)。
抗生素 (選擇性使用): 在培養(yǎng)基中添加特定抗生素（如細(xì)菌抑制劑氯霉素、鏈霉素，或抗真菌劑如放線菌酮。注意：放線菌酮對(duì)許多真菌也有毒性，需謹(jǐn)慎選擇濃度和對(duì)象）可以抑制特定污染物的生長(zhǎng)。但這不能替代無(wú)菌操作，且可能影響目標(biāo)真菌的生長(zhǎng)或代謝。
四、培養(yǎng)環(huán)境的控制
培養(yǎng)箱/培養(yǎng)室清潔:
定期清潔和消毒培養(yǎng)箱內(nèi)部（用70%乙醇或?qū)Ｓ孟緞┎潦茫?/div>
避免在培養(yǎng)箱內(nèi)存放過(guò)期或已污染的培養(yǎng)物。
定期檢查培養(yǎng)箱內(nèi)的水盤（用于加濕），防止其成為污染源（可加少量硫酸銅或定期更換滅菌水）。
容器密封: 確保培養(yǎng)皿封口嚴(yán)密，試管塞或蓋子松緊適度（既要透氣又要防污染，試管棉塞不能過(guò)松或過(guò)緊）。使用透氣封口膜是較好的選擇。
避免冷凝水: 倒置培養(yǎng)平板，防止冷凝水滴落到菌落上造成污染或擴(kuò)散。
隔離觀察: 新接入的培養(yǎng)物或來(lái)源不確定的培養(yǎng)物，建議在初期與其他重要培養(yǎng)物分開存放觀察，確認(rèn)無(wú)污染后再轉(zhuǎn)移。
五、良好的實(shí)驗(yàn)習(xí)慣與管理
單向工作流: 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)應(yīng)遵循從“潔凈區(qū)”到“污染區(qū)”的單向流動(dòng)。例如，先準(zhǔn)備無(wú)菌物品和培養(yǎng)基，再進(jìn)行接種操作，最后處理廢棄物。避免在無(wú)菌區(qū)處理污染物品后又返回操作無(wú)菌材料。
標(biāo)記清晰: 所有培養(yǎng)物、培養(yǎng)基、試劑瓶都要清晰、及時(shí)地標(biāo)記名稱、日期等信息。
定期檢查: 培養(yǎng)期間定期（如每天或隔天）觀察培養(yǎng)物，一旦發(fā)現(xiàn)污染跡象（非目標(biāo)菌落形態(tài)、渾濁液體、異味等），立即隔離并處理掉污染品。
及時(shí)清理: 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后立即清理工作臺(tái)，將所有廢棄物（尤其是污染的培養(yǎng)物、吸頭、手套等）放入專用的生物危害廢物袋/桶中進(jìn)行高壓滅菌處理。用消毒劑擦拭臺(tái)面。
儀器維護(hù): 定期對(duì)超凈工作臺(tái)/生物安全柜進(jìn)行維護(hù)和高效濾網(wǎng)更換（按廠家建議或監(jiān)測(cè)氣流速度下降時(shí)）。定期校準(zhǔn)培養(yǎng)箱溫度。
六、總結(jié)
避免真菌培養(yǎng)污染是一項(xiàng)系統(tǒng)工程，需要無(wú)菌意識(shí)、規(guī)范操作、嚴(yán)格滅菌、環(huán)境控制和良好習(xí)慣的結(jié)合。無(wú)菌操作技術(shù)是核心防線，任何環(huán)節(jié)的疏忽都可能導(dǎo)致前功盡棄。養(yǎng)成嚴(yán)謹(jǐn)細(xì)致的實(shí)驗(yàn)習(xí)慣是成功的關(guān)鍵。根據(jù)你的具體實(shí)驗(yàn)類型（如純培養(yǎng)、發(fā)酵、致病真菌研究、食用菌栽培等），可能還需要在上述通用原則基礎(chǔ)上采取一些特定的防護(hù)措施。
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