假單胞分離瓊脂培養(yǎng)基的實驗原理和使用方法及主要應(yīng)用！
小楊 / 2025-06-25 09:49:34
假單胞分離瓊脂（Pseudomonas Isolation Agar, PIA）是一種選擇性培養(yǎng)基，專門設(shè)計用于從含有多種微生物的樣本（如臨床樣本、環(huán)境樣本、食品等）中分離和初步鑒定
假單胞菌屬（Pseudomonas spp.），尤其是臨床上重要的
銅綠假單胞菌（P. aeruginosa）。
一、原理
PIA 的選擇性和鑒別性主要基于以下關(guān)鍵成分：
溴化十六烷基三甲銨：
作用：這是培養(yǎng)基的核心選擇性成分。CTAB 是一種季銨鹽類陽離子表面活性劑/消毒劑。
機制：CTAB 能有效抑制大多數(shù)革蘭氏陽性細菌和許多革蘭氏陰性細菌的生長。它對細胞膜具有破壞作用。
選擇性：
假單胞菌屬，特別是
銅綠假單胞菌，對 CTAB 具有天然耐受性（主要是由于其外膜結(jié)構(gòu)和主動外排泵機制），能夠在含有 CTAB 的培養(yǎng)基上生長，而其他許多細菌則被抑制或殺死。
明膠：
作用：提供氮源和碳源，同時也是鑒別性成分。
機制：某些假單胞菌（如
銅綠假單胞菌）能產(chǎn)生明膠酶（一種蛋白酶）。
鑒別性：在培養(yǎng)后，將平板（或取出部分菌落）浸入酸性汞試劑中。如果細菌水解了明膠，培養(yǎng)基中原本不溶性的明膠被分解，導(dǎo)致培養(yǎng)基在試劑作用下出現(xiàn)清晰的透明暈圈（水解區(qū)）圍繞在菌落周圍。未水解明膠的區(qū)域則呈現(xiàn)渾濁或不透明。這是鑒定銅綠假單胞菌的一個重要特征（通常陽性）。
甘油：
作用：主要作為可發(fā)酵的碳源。
機制：
假單胞菌屬通常不能發(fā)酵糖類產(chǎn)酸，但它們可以利用甘油進行氧化代謝。雖然PIA不直接用于觀察酸產(chǎn)生（不像一些含指示劑的培養(yǎng)基），但甘油提供能量支持其生長。
氯化鉀：
作用：提供鉀離子，可能有助于增強CTAB的抑制效果或優(yōu)化滲透壓。
硫酸鎂：
作用：提供鎂離子，是許多酶促反應(yīng)必需的輔助因子，促進假單胞菌生長和色素的產(chǎn)生。
瓊脂：固化劑。
總結(jié)原理：CTAB 抑制了絕大多數(shù)非假單胞菌的細菌，允許耐受的假單胞菌生長。明膠水解試驗（需要額外試劑處理）可用于初步區(qū)分能產(chǎn)生明膠酶的假單胞菌（如
銅綠假單胞菌）與其他可能耐受CTAB但明膠酶陰性的細菌。此外，
銅綠假單胞菌在PIA上通常會產(chǎn)生特征性的色素（藍綠色的綠膿菌素和/或黃綠色的熒光素，在紫外燈下觀察熒光更明顯），這也是重要的鑒定線索。
二、使用方法
培養(yǎng)基制備：
根據(jù)制造商說明稱取規(guī)定量的PIA干粉。
加入適量蒸餾水或去離子水，攪拌混勻。
加熱煮沸使其完全溶解。
分裝到適當?shù)娜萜鳎ㄈ缭嚬芑蛉瞧浚?/div>
高壓滅菌：121°C (15 psi) 滅菌15分鐘。
倒平板：待培養(yǎng)基冷卻至約45-50°C（不燙手但尚未凝固），在無菌條件下將其倒入無菌培養(yǎng)皿中（通常每皿約15-20ml）。
凝固與干燥：讓平板在室溫下完全凝固。使用前最好將蓋子微開，在生物安全柜或烘箱中（約35-37°C）放置短時間（15-30分鐘）以去除表面冷凝水（但避免過度干燥）。
樣本接種：
根據(jù)樣本類型（如痰液、膿液、傷口拭子、水樣、食品勻液等）進行適當?shù)那疤幚恚ㄈ缇|(zhì)化、稀釋）。
劃線分離：使用標準的平板劃線分離技術(shù)（如四區(qū)劃線法）將樣本接種到PIA平板上。目的是獲得單個分離的菌落。
點種：如果已有純培養(yǎng)或可疑菌落，也可點種到PIA上進行驗證。
培養(yǎng)：
溫度：將接種好的平板倒置（防止冷凝水滴落）放入培養(yǎng)箱。
主要溫度：35-37°C（用于一般分離）。
關(guān)鍵溫度（提高選擇性）：對于特別要求高選擇性（如抑制其他耐CTAB的非假單胞菌）或針對銅綠假單胞菌，42°C培養(yǎng)是強烈推薦甚至必需的。銅綠假單胞菌能在42°C生長良好，而許多其他細菌（包括一些假單胞菌）則不能。
時間：培養(yǎng) 18-24小時通常足夠觀察結(jié)果。如果24小時后生長稀少或未觀察到特征色素，可延長培養(yǎng)至48小時（銅綠假單胞菌的色素產(chǎn)生有時需要更長時間）。
結(jié)果判讀：
生長觀察：檢查平板上是否有細菌生長。在CTAB存在下生長的菌落高度提示假單胞菌屬。
色素觀察：
在白光下觀察菌落顏色。
銅綠假單胞菌常產(chǎn)生藍綠色（綠膿菌素） 和/或黃綠色（熒光素） 的擴散性色素。色素可能滲入培養(yǎng)基中。有些菌株可能只產(chǎn)生一種色素或不產(chǎn)生。
在紫外燈（長波，~366nm） 下觀察。銅綠假單胞菌產(chǎn)生的熒光素會發(fā)出黃綠色熒光。這是非常有價值的鑒定特征。
明膠水解試驗（需要額外步驟）：
方法一（平板直接法）：向培養(yǎng)好的平板表面傾注足量的Frazier’s明膠水解試劑（含HgCl?的酸性溶液），覆蓋整個表面，靜置約10-20分鐘。倒掉多余試劑（按生物危害廢物處理），觀察平板。
方法二（菌落挑取法）：用無菌接種環(huán)挑取單個菌落，涂抹或穿刺接種到營養(yǎng)明膠培養(yǎng)基（如試管裝）中，在35-37°C培養(yǎng)最多7天。每天觀察或培養(yǎng)后將試管置4°C冰箱30分鐘，檢查明膠是否液化（不凝固）。
結(jié)果判讀：菌落周圍或下方出現(xiàn)清晰的透明區(qū)（水解圈），而培養(yǎng)基其他區(qū)域呈渾濁或不透明，即為明膠水解陽性。無透明區(qū)則為陰性。銅綠假單胞菌通常為陽性。
菌落形態(tài)：假單胞菌在PIA上的菌落通常較大、扁平、邊緣不規(guī)則、擴散狀、表面有光澤、濕潤，有時呈粘液狀。色素是其最顯著特征。
三、應(yīng)用與局限性
主要應(yīng)用：
初步鑒定銅綠假單胞菌（基于CTAB耐受、42°C生長、色素產(chǎn)生、明膠水解陽性）。
環(huán)境、食品、水及臨床樣本（特別是囊性纖維化患者呼吸道樣本）中假單胞菌的檢測。
局限性：
并非所有假單胞菌都對CTAB耐受（盡管主要致病種耐受）。
色素產(chǎn)生不穩(wěn)定：并非所有銅綠假單胞菌菌株都產(chǎn)生色素（尤其是臨床分離株）。
明膠水解試驗需要額外操作和試劑。
最終鑒定仍需結(jié)合革蘭氏染色、氧化酶試驗、生化試驗或分子方法進行確認。
四、重要注意事項
CTAB具有刺激性，操作干粉和配制培養(yǎng)基時需佩戴手套、口罩和護目鏡。
明膠水解試劑（含汞）有劇毒，操作需極其小心，在通風櫥中進行，并按規(guī)定處理廢液。
42°C培養(yǎng)是提高選擇性和特異性（針對
銅綠假單胞菌）的關(guān)鍵步驟。
培養(yǎng)后應(yīng)盡快觀察色素（特別是熒光），因為色素可能隨時間擴散或降解。
菌落形態(tài)和色素是初步線索，必須通過進一步的鑒定試驗來確認菌種。
總而言之，
假單胞分離瓊脂通過CTAB的強選擇性抑制和明膠水解的鑒別性，結(jié)合色素觀察和溫度控制（42°C），是實驗室分離和初步鑒定假單胞菌屬，特別是銅綠假單胞菌的有力工具。
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