純菌株生長率的常用測定方法及核心步驟與注意事項(xiàng)！
小楊 / 2025-06-24 09:13:50
百歐博偉生物：測定純菌株的生長率是微生物學(xué)中的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)，核心在于精確追蹤特定培養(yǎng)條件下活菌數(shù)量或生物量隨時(shí)間的變化，尤其是在對(duì)數(shù)生長期的指數(shù)增長速率。以下是常用的測定方法和關(guān)鍵步驟：
一、常用測定方法
1、平板菌落計(jì)數(shù)法（最準(zhǔn)確，測活菌數(shù)）
原理：將菌液梯度稀釋，涂布平板培養(yǎng)后計(jì)數(shù)單菌落（CFU）。
步驟：
定期取樣（如0, 2, 4, 6, 8, 24小時(shí)）。
用無菌生理鹽水或緩沖液進(jìn)行十倍系列稀釋。
取適宜稀釋度的菌液涂布或傾注平板（通常做3個(gè)平行）。
適宜溫度下培養(yǎng)24-48小時(shí)，計(jì)數(shù)30-300 CFU的平板。
計(jì)算每毫升原菌液中的活菌數(shù)（CFU/mL）。
優(yōu)點(diǎn)：直接測定活菌數(shù)，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
缺點(diǎn)：操作繁瑣、耗時(shí)長、無法實(shí)時(shí)監(jiān)測。
2、分光光度法（測濁度，間接反映生物量）
原理：利用菌體懸浮液對(duì)光的散射（OD值），常用波長600 nm（OD???）。
步驟：
在無菌錐形瓶（如含100mL培養(yǎng)基）中接種少量純菌株（確保初始OD低）。
置于搖床（恒溫、適宜轉(zhuǎn)速）培養(yǎng)。
定期取樣，用未接種的培養(yǎng)基作空白對(duì)照，測定OD???值。
記錄OD值隨時(shí)間的變化。
優(yōu)點(diǎn)：快速、簡便、非破壞性、可實(shí)時(shí)/半實(shí)時(shí)監(jiān)測。
缺點(diǎn)：
測定的是總生物量（包括死菌），不區(qū)分活菌。
需建立OD???與CFU/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線（通過平板計(jì)數(shù)校準(zhǔn)）。
僅適用于均勻懸浮生長的菌株（不適用于成團(tuán)、成膜菌）。
線性范圍有限（通常OD??? < 0.5），超過后需稀釋再測。
3、干重法（直接測生物量總量）
原理：收集菌體，洗凈干燥后稱重。
步驟：
取一定體積培養(yǎng)液，離心收集菌體。
用無菌水或緩沖液洗滌數(shù)次（去除培養(yǎng)基殘留）。
將菌體轉(zhuǎn)移至已稱重的濾膜或離心管，在105°C烘干至恒重。
冷卻后稱重，計(jì)算單位體積培養(yǎng)液的菌體干重（mg/mL或 g/L）。
優(yōu)點(diǎn)：直接測量生物量總量，結(jié)果直觀。
缺點(diǎn)：破壞性取樣、操作繁瑣、耗時(shí)、靈敏度較低（需大量菌體）。
4、流式細(xì)胞術(shù)（FCM）
原理：用熒光染料區(qū)分活/死菌，快速計(jì)數(shù)單細(xì)胞。
優(yōu)點(diǎn)：高通量、可區(qū)分生理狀態(tài)、快速。
缺點(diǎn)：儀器昂貴、需優(yōu)化染色條件。
二、核心步驟與注意事項(xiàng)
1、菌株與培養(yǎng)基：
確保使用純培養(yǎng)物（單菌落來源）。
選擇最適培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件（溫度、pH、溶氧等）。
2、接種：
使用對(duì)數(shù)生長期的新鮮菌液接種。
接種量宜小（如1%），確保初始菌密度低（OD??? ≈ 0.05），能清晰觀察到完整的生長曲線。
3、取樣與時(shí)間點(diǎn)：
對(duì)數(shù)生長期需密集取樣（如每30-60分鐘），延滯期和穩(wěn)定期間隔可延長。
嚴(yán)格保持無菌操作。
每次取樣后立即測定或適當(dāng)保存（如4°C冷藏，盡快處理）。
4、平行與重復(fù)：
必須設(shè)置生物學(xué)重復(fù)（≥3個(gè)平行培養(yǎng)物）。
每次測定設(shè)置技術(shù)重復(fù)（如測OD時(shí)讀3次取平均；平板計(jì)數(shù)做3個(gè)平行平板）。
5、數(shù)據(jù)記錄：
精確記錄取樣時(shí)間、培養(yǎng)條件、稀釋倍數(shù)、測量值等。
三、計(jì)算生長率
1、繪制生長曲線：
以時(shí)間（小時(shí)）為橫坐標(biāo)，以對(duì)數(shù)坐標(biāo)下的CFU/mL（或OD???、干重）為縱坐標(biāo)作圖。
識(shí)別出對(duì)數(shù)生長期（直線段）。
2、計(jì)算比生長速率（μ）：
在對(duì)數(shù)生長期，菌體數(shù)量呈指數(shù)增長：N_t = N_0 * e^(μt)
比生長速率公式：μ = (ln N_t - ln N_0) / (t - t_0)（單位：h?¹）
N_t：時(shí)間t時(shí)的菌量（CFU/mL 或 OD???）
N_0：時(shí)間t?時(shí)的菌量
t - t_0：時(shí)間間隔（小時(shí)）
3、計(jì)算代時(shí)（Generation Time, Doubling Time）：
代時(shí)（g）是菌量翻倍所需的時(shí)間：g = ln2 / μ ≈ 0.693 / μ（單位：小時(shí)）
四、關(guān)鍵注意事項(xiàng)
校準(zhǔn)：使用OD法時(shí)，必須用平板計(jì)數(shù)法建立該菌株在特定條件下的OD??? - CFU/mL標(biāo)準(zhǔn)曲線。
范圍：OD法僅在低OD值范圍內(nèi)（通常<0.5）與細(xì)胞濃度呈線性關(guān)系，超出范圍需稀釋。
對(duì)照：分光光度法必須用未接種的培養(yǎng)基調(diào)零（空白對(duì)照）。
穩(wěn)定性：嚴(yán)格控制培養(yǎng)條件（溫度、搖床轉(zhuǎn)速），避免波動(dòng)影響結(jié)果。
生理狀態(tài)：接種菌株的生理狀態(tài)和培養(yǎng)歷史需保持一致。
曲線完整性：確保取樣覆蓋所有生長時(shí)期，尤其是對(duì)數(shù)期早期。
五、總結(jié)
推薦組合：分光光度法（實(shí)時(shí)監(jiān)測OD）+ 平板計(jì)數(shù)法（關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)校準(zhǔn)）是最常用且可靠的方法。
核心輸出：比生長速率（μ）和代時(shí)（g）是衡量純菌株生長能力的核心參數(shù)。
嚴(yán)謹(jǐn)性：嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、無菌操作、充分的平行重復(fù)和準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)記錄是獲得可靠結(jié)果的基礎(chǔ)。
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