大腸菌群初發(fā)酵與復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)的方法及常見問題與解決方案！
小楊 / 2025-12-19 09:34:37
大腸菌群的初發(fā)酵與復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)是食品、飲用水等樣品中大腸菌群檢測的經(jīng)典方法，核心原理是利用大腸菌群發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的生理特性，通過兩步試驗(yàn)完成定性與定量判定，以下是完整的操作知識包。
一、試驗(yàn)原理
大腸菌群是一群革蘭氏陰性、無芽孢、需氧或兼性厭氧的桿菌，在 36℃左右的條件下，能在 24～48h 內(nèi)發(fā)酵乳糖，產(chǎn)生乳酸等有機(jī)酸和二氧化碳等氣體。
初發(fā)酵：通過乳糖膽鹽培養(yǎng)基（含膽鹽可抑制革蘭氏陽性菌生長），初步篩選出能發(fā)酵乳糖產(chǎn)氣的可疑陽性管。
復(fù)發(fā)酵：對初發(fā)酵的可疑陽性管進(jìn)行分離培養(yǎng)和再次發(fā)酵驗(yàn)證，排除假陽性，確認(rèn)大腸菌群的存在。
二、操作方法
（一）樣品前處理
根據(jù)樣品類型（固體、液體）進(jìn)行不同處理：
液體樣品（如飲用水、飲料）：搖勻后直接取樣，或用無菌生理鹽水稀釋。
固體樣品（如食品）：稱取 25g 樣品，加入 225mL 無菌生理鹽水，均質(zhì)制成 1:10 的勻液，再根據(jù)污染程度做系列稀釋（如 10?²、10?³ 等）。
（二）初發(fā)酵試驗(yàn)
選取 3 個(gè)適宜的稀釋度，每個(gè)稀釋度接種 3 管乳糖膽鹽發(fā)酵管，每管接種 1mL 稀釋液（或原液）。
將接種后的發(fā)酵管置于 36℃±1℃ 培養(yǎng)箱中，培養(yǎng) 24h±2h。
觀察結(jié)果：
若發(fā)酵管內(nèi)產(chǎn)酸（培養(yǎng)基由紫色變?yōu)辄S色）且產(chǎn)氣（杜氏小管內(nèi)有氣體），記為初發(fā)酵可疑陽性；
若無產(chǎn)氣或只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，記為陰性。
若 24h 未產(chǎn)氣，可繼續(xù)培養(yǎng)至 48h，仍無氣體則判定為陰性。
（三）復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)
挑取初發(fā)酵可疑陽性管中的培養(yǎng)物，劃線接種于 伊紅美藍(lán)瓊脂（EMB） 平板上。
置于 36℃±1℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng) 18～24h。
觀察菌落形態(tài)：大腸菌群在 EMB 平板上的典型菌落為 紫黑色、有金屬光澤，或呈淡紫紅色、中心較深的菌落。
從典型菌落中挑取 2～3 個(gè)，接種到乳糖發(fā)酵管中，36℃±1℃培養(yǎng) 24h±2h。
若乳糖發(fā)酵管產(chǎn)酸產(chǎn)氣，則判定為復(fù)發(fā)酵陽性，確認(rèn)存在大腸菌群；反之則為陰性。
三、注意事項(xiàng)
無菌操作：全程需嚴(yán)格無菌，避免環(huán)境中的雜菌污染樣品或培養(yǎng)基，否則會導(dǎo)致假陽性。
培養(yǎng)基質(zhì)量
乳糖膽鹽發(fā)酵管的 pH 需準(zhǔn)確（約 7.4），膽鹽濃度要適宜，過高會抑制大腸菌群生長，過低則無法有效抑制革蘭氏陽性菌。
EMB 瓊脂需新鮮配制，避免出現(xiàn)干裂或污染。
培養(yǎng)條件控制：溫度和時(shí)間需嚴(yán)格遵守，溫度過高或過低會影響大腸菌群的代謝活性，導(dǎo)致產(chǎn)酸產(chǎn)氣能力下降。
稀釋度選擇：需根據(jù)樣品污染情況選擇合適的稀釋度，確保至少有一個(gè)稀釋度的發(fā)酵管出現(xiàn)陽性，且陽性管數(shù)在 3～6 管之間，便于計(jì)數(shù)。
菌落挑?。簭?fù)發(fā)酵時(shí)優(yōu)先挑取典型菌落，若無可典型菌落，可挑取可疑菌落進(jìn)行驗(yàn)證，避免漏檢。
四、應(yīng)用范圍
食品安全檢測：用于各類食品（如肉制品、乳制品、糕點(diǎn)、果蔬等）的大腸菌群篩查，判斷食品是否受腸道致病菌污染。
飲用水與水質(zhì)監(jiān)測：檢測飲用水、水源水、污水等的大腸菌群數(shù)量，評估水質(zhì)衛(wèi)生狀況。
環(huán)境樣品檢測：監(jiān)測土壤、空氣等環(huán)境樣品中的糞便污染程度。
五、常見問題及解決方案
常見問題 原因分析 解決方案
初發(fā)酵假陽性（非大腸菌群產(chǎn)氣） 革蘭氏陽性菌未被膽鹽完全抑制，或樣品中存在其他發(fā)酵乳糖的雜菌 提高膽鹽濃度；嚴(yán)格控制培養(yǎng)溫度和時(shí)間；復(fù)發(fā)酵時(shí)嚴(yán)格篩選典型菌落
初發(fā)酵假陰性（大腸菌群未產(chǎn)氣） 稀釋度過高，接種的菌量不足；膽鹽濃度過高抑制目標(biāo)菌；培養(yǎng)時(shí)間不足 選擇合適的稀釋度；調(diào)整培養(yǎng)基膽鹽濃度；延長培養(yǎng)至 48h 觀察
EMB 平板上無典型菌落 接種量過少；培養(yǎng)溫度不適；菌落未長出 增加接種量；校準(zhǔn)培養(yǎng)箱溫度；延長培養(yǎng)至 24h
復(fù)發(fā)酵陽性率低 挑取的菌落非大腸菌群；乳糖發(fā)酵管質(zhì)量問題 優(yōu)先挑取紫黑色有金屬光澤的典型菌落；驗(yàn)證乳糖發(fā)酵管的有效性
六、結(jié)果計(jì)算
根據(jù)復(fù)發(fā)酵陽性的管數(shù)，查閱大腸菌群最可能數(shù)（MPN）檢索表，計(jì)算每克（或每毫升）樣品中的大腸菌群 MPN 值。
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