菌種保藏過(guò)程中避免雜菌污染是保證保藏效果的核心前提！
小楊 / 2025-07-24 10:07:53
百歐博偉生物：在菌種保藏過(guò)程中，避免雜菌污染是保證保藏效果的核心前提之一（污染會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)菌株被取代或性狀干擾）。污染可能來(lái)自操作環(huán)境、實(shí)驗(yàn)器具、操作人員、原始菌株本身等，需通過(guò)“全流程防控”實(shí)現(xiàn)無(wú)菌化，具體措施可分為以下幾個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)：
一、保藏前：確保原始菌株“純凈”且操作環(huán)境無(wú)菌
1、原始菌株的純化與驗(yàn)證
保藏的菌株必須是單一純種，保藏前需通過(guò)平板劃線、稀釋涂布等方法純化，觀察菌落形態(tài)是否均一（如大小、顏色、邊緣、質(zhì)地等無(wú)雜菌特征）。
必要時(shí)結(jié)合顯微鏡觀察（如細(xì)菌的形態(tài)、真菌的孢子結(jié)構(gòu)）或生理生化實(shí)驗(yàn)（如特定培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)特性），確認(rèn)無(wú)雜菌后再進(jìn)行保藏。
例：若保藏酵母菌，需排除細(xì)菌污染 —— 可在加有抗生素（如青霉素）的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，細(xì)菌無(wú)法生長(zhǎng)而酵母菌存活。
2、操作環(huán)境的無(wú)菌控制
核心操作需在超凈工作臺(tái)（生物安全柜） 內(nèi)進(jìn)行，提前 30 分鐘開(kāi)啟紫外燈消毒（15-30 分鐘），并通風(fēng)去除臭氧。
定期清潔超凈臺(tái)內(nèi)部（用 75% 酒精擦拭臺(tái)面、側(cè)壁），避免殘留污染物；工作臺(tái)外環(huán)境需保持整潔，減少空氣揚(yáng)塵。
若進(jìn)行冷凍干燥、液氮保藏等復(fù)雜操作，需在無(wú)菌室中進(jìn)行，定期監(jiān)測(cè)環(huán)境菌落數(shù)（如沉降菌檢測(cè)）。
3、實(shí)驗(yàn)器具與試劑的無(wú)菌處理
玻璃器皿（試管、培養(yǎng)皿、移液管）、金屬工具（接種環(huán)、鑷子）需干熱滅菌（160-180℃，2-3 小時(shí)）或高壓蒸汽滅菌（121℃，15-30 分鐘），滅菌后妥善存放（如滅菌后的試管塞需避免接觸非無(wú)菌表面）。
液體試劑（如培養(yǎng)基、甘油溶液、冷凍保護(hù)劑）需高壓蒸汽滅菌；固體培養(yǎng)基滅菌后需倒平板，待凝固后檢查是否有污染（如無(wú)雜菌菌落）。
特殊試劑（如用于冷凍干燥的保護(hù)劑）若無(wú)法高溫滅菌，需通過(guò)濾膜過(guò)濾（0.22μm 孔徑）除菌。
二、保藏操作中：嚴(yán)格無(wú)菌操作，避免交叉污染
1、操作人員的無(wú)菌規(guī)范
操作前需洗手并消毒（75% 酒精擦拭），穿戴無(wú)菌手套、口罩、實(shí)驗(yàn)服，避免手部、呼吸產(chǎn)生的微生物污染。
接種工具（接種環(huán)、移液管）使用前需灼燒滅菌（接種環(huán)在酒精燈火焰上燒至紅熱，冷卻后使用，避免燙死目標(biāo)菌株），每處理一個(gè)菌株后需重新滅菌，嚴(yán)禁交叉使用。
2、菌株轉(zhuǎn)移與分裝的無(wú)菌性
轉(zhuǎn)移菌株時(shí)（如從斜面接種到甘油管），試管口需在酒精燈火焰附近操作（形成無(wú)菌區(qū)），開(kāi)塞后試管口快速過(guò)火焰滅菌，避免空氣雜菌進(jìn)入。
分裝保藏容器（如冷凍管、凍干安瓿瓶）時(shí)，需確保容器已滅菌，且分裝過(guò)程中開(kāi)口時(shí)間盡量縮短，避免暴露于空氣中過(guò)久。
若保藏多個(gè)菌株，需標(biāo)記清晰（菌株名稱、編號(hào)、保藏日期），并分開(kāi)操作，避免容器混淆或液體濺灑導(dǎo)致交叉污染。
3、不同保藏方法的針對(duì)性防護(hù)
冷凍干燥保藏：安瓿瓶封口前需確保內(nèi)部為真空狀態(tài)，封口時(shí)火焰灼燒密封，避免漏氣導(dǎo)致雜菌侵入。
液氮保藏：液氮罐需定期清潔，避免罐內(nèi)殘留的水或污染物進(jìn)入保藏管；保藏管需使用耐低溫、密封良好的專用容器（如螺旋蓋冷凍管），防止液氮滲入或管內(nèi)菌株泄漏。
斜面保藏：接種后斜面需直立培養(yǎng)至菌落長(zhǎng)出，確認(rèn)無(wú)雜菌后再放入 4℃冰箱，冰箱內(nèi)避免存放易污染的物品（如未密封的培養(yǎng)基）。
三、保藏后：儲(chǔ)存環(huán)境維護(hù)與定期監(jiān)測(cè)
1、儲(chǔ)存環(huán)境的清潔與穩(wěn)定
冰箱、液氮罐、凍干管儲(chǔ)存盒等需定期清潔消毒（如冰箱內(nèi)壁用 75% 酒精擦拭，液氮罐定期更換液氮并清理底部雜質(zhì)）。
不同類型菌株（如致病菌、普通菌株）需分開(kāi)儲(chǔ)存，避免交叉污染風(fēng)險(xiǎn)；保藏區(qū)域需干燥、避光，減少環(huán)境微生物滋生。
2、定期檢查與復(fù)蘇驗(yàn)證
即使長(zhǎng)期保藏，也需定期檢查保藏容器是否破損、密封是否完好（如冷凍管是否開(kāi)裂、安瓿瓶是否漏氣），及時(shí)淘汰可疑容器。
對(duì)保藏菌株進(jìn)行定期復(fù)蘇（如每 1-2 年）：將菌株接種到新鮮培養(yǎng)基，觀察生長(zhǎng)狀態(tài)和菌落純度，若發(fā)現(xiàn)雜菌，需重新純化后再次保藏。
復(fù)蘇后的菌株需再次驗(yàn)證遺傳性狀（如代謝產(chǎn)物合成能力、形態(tài)特征），確保未因污染或變異改變特性。
四、總結(jié)：核心原則
菌種保藏防污染的關(guān)鍵是“源頭控制（菌株純、器具凈）+ 過(guò)程無(wú)菌（操作規(guī)范）+ 環(huán)境穩(wěn)定（儲(chǔ)存安全）”。任何環(huán)節(jié)的疏忽都可能導(dǎo)致污染，因此需嚴(yán)格遵循無(wú)菌操作流程，尤其注意 “一人一菌一工具”（避免交叉）和“全程無(wú)菌區(qū)操作”（減少環(huán)境雜菌接觸）。對(duì)于珍貴菌株，建議采用“多方法備份保藏”（如同時(shí)冷凍干燥和液氮保藏），進(jìn)一步降低污染或丟失風(fēng)險(xiǎn)。
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