細(xì)胞培養(yǎng)實驗中避免細(xì)胞系交叉污染的預(yù)防策略和實踐指南！
小楊 / 2025-06-27 09:40:56
百歐博偉生物：避免細(xì)胞系交叉污染是細(xì)胞培養(yǎng)實驗中最關(guān)鍵的質(zhì)量控制環(huán)節(jié)之一，一旦發(fā)生，會徹底摧毀實驗結(jié)果的可靠性、可重復(fù)性和科學(xué)性。交叉污染通常是由于操作不當(dāng)導(dǎo)致一種細(xì)胞意外混入另一種細(xì)胞的培養(yǎng)體系中，最終導(dǎo)致培養(yǎng)物被錯誤細(xì)胞完全取代。以下是一套綜合性的預(yù)防策略和實踐指南：
一、嚴(yán)格的實驗室操作規(guī)范 (核心防線)
1、"一種細(xì)胞，一個區(qū)域，一個時間段"原則:
物理分隔：如果可能，為不同細(xì)胞系（尤其是易污染者）指定不同的生物安全柜或工作區(qū)域。
時間分隔：每次只處理一種細(xì)胞系。處理完一種細(xì)胞后，徹底清潔工作區(qū)、移液器表面、手套等，再進行下一種細(xì)胞的操作。避免同時打開多種細(xì)胞的培養(yǎng)瓶。
專用設(shè)備：為關(guān)鍵細(xì)胞系（或高風(fēng)險系）配備專用移液器、吸頭盒、培養(yǎng)瓶、試劑瓶等。
2、清晰無誤的標(biāo)記:
在培養(yǎng)瓶/皿、凍存管、試劑瓶上立即、清晰、完整地標(biāo)記細(xì)胞系名稱、代次、日期、操作者姓名。使用防水筆或?qū)Ｓ脴?biāo)簽。
避免將不同細(xì)胞系的瓶子放在一起，以免混淆。
在實驗記錄本上詳細(xì)記錄操作步驟和細(xì)胞信息。
3、無菌操作技術(shù)強化:
移液器使用：絕對避免移液器吸頭接觸任何非目標(biāo)液體（如其他培養(yǎng)瓶內(nèi)壁、瓶蓋內(nèi)面、工作臺面）。每次吸液更換新吸頭。定期對移液器進行表面消毒。
試劑分裝：培養(yǎng)基、胰酶、PBS 等試劑應(yīng)分裝成小份，專瓶專用于特定細(xì)胞系。絕對避免將移液器/吸管直接插入主試劑瓶中吸取，應(yīng)倒出所需量到無菌容器中使用。主試劑瓶應(yīng)保持專用或嚴(yán)格管理。
瓶蓋管理：打開培養(yǎng)瓶或試劑瓶時，瓶蓋應(yīng)內(nèi)面朝上放置在無菌區(qū)域（如用酒精擦拭過的紙巾上），避免接觸臺面。操作完成后立即蓋緊。
避免產(chǎn)生氣溶膠：操作時動作輕柔，避免劇烈搖晃、吹打產(chǎn)生過多氣泡和氣溶膠（氣溶膠是交叉污染的重要途徑！）。
手套管理：頻繁更換手套，尤其是在接觸不同細(xì)胞系之間。接觸可能污染的表面（門把手、電話、電腦）后必須更換手套或徹底消毒后才能繼續(xù)細(xì)胞操作。
4、培養(yǎng)基和添加劑專用化: 盡可能為每種細(xì)胞系配制和使用其專用的完全培養(yǎng)基。如果需要添加抗生素或其他添加劑，確保操作過程無菌且專用。
二、建立和使用細(xì)胞庫體系
1、主細(xì)胞庫和工作細(xì)胞庫：
主細(xì)胞庫：在細(xì)胞引入實驗室后，盡快擴增并凍存足夠量的早期代次細(xì)胞。這些細(xì)胞僅用于復(fù)蘇建立工作庫或珍貴實驗。
工作細(xì)胞庫：從主庫復(fù)蘇細(xì)胞，擴增后再次凍存一批細(xì)胞。日常實驗使用工作庫的細(xì)胞。
定期回補：工作庫細(xì)胞使用一定時間或一定代次后，丟棄舊的工作庫，從主庫復(fù)蘇細(xì)胞重新建立新的工作庫。
2、凍存管理：
凍存前確保細(xì)胞狀態(tài)良好且經(jīng)過鑒定。
清晰標(biāo)記凍存管（名稱、代次、日期、凍存液、操作者）。
使用程序降溫盒或程控降溫儀。
儲存在液氮氣相中（避免交叉污染風(fēng)險最高的液相儲存）。
凍存盒/架清晰標(biāo)記，不同細(xì)胞系分區(qū)存放。
三、定期進行細(xì)胞系鑒定 (金標(biāo)準(zhǔn))
1、STR 分析：這是目前國際公認(rèn)的、最準(zhǔn)確可靠的細(xì)胞系鑒定方法。它通過檢測細(xì)胞基因組中多個短串聯(lián)重復(fù)序列位點的等位基因圖譜來建立細(xì)胞的"DNA指紋"。應(yīng)：
入庫必檢：任何新引入的細(xì)胞系，在建立主細(xì)胞庫前必須進行STR鑒定。
定期檢測：工作細(xì)胞庫的細(xì)胞在復(fù)蘇使用前，以及連續(xù)傳代過程中（建議每2-3個月或傳代10-15次后）都應(yīng)進行STR鑒定。
懷疑即檢：如果細(xì)胞形態(tài)、生長速度等發(fā)生異常變化，或?qū)嶒灲Y(jié)果出現(xiàn)無法解釋的異常，立即進行STR檢測。
比對數(shù)據(jù)庫：將STR圖譜與國際標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫中該細(xì)胞系的參考圖譜進行比對。同時也可與實驗室保存的該細(xì)胞系早期圖譜比對。
2、同工酶分析：通過電泳檢測細(xì)胞中特定酶的異構(gòu)體模式，可以區(qū)分不同物種來源的細(xì)胞。是STR分析的有力補充。
3、種屬特異性檢測：如PCR檢測種屬特異性基因片段，快速判斷是否有異種污染。
4、形態(tài)學(xué)觀察：雖然不能作為鑒定依據(jù)（形態(tài)會變），但熟悉細(xì)胞的正常形態(tài)是發(fā)現(xiàn)異常（如突然出現(xiàn)形態(tài)迥異的細(xì)胞）的第一道警報。
四、良好的實驗室管理和培訓(xùn)
1、專人負(fù)責(zé)：指定人員負(fù)責(zé)細(xì)胞庫的管理、維護、鑒定和發(fā)放。
2、嚴(yán)格記錄：建立完善的細(xì)胞系檔案，包括來源證明、鑒定報告、傳代記錄、凍存記錄、使用記錄等。
3、共享規(guī)范：實驗室內(nèi)部共享細(xì)胞系時，必須附帶最新的鑒定報告。接收外部細(xì)胞系時，要求提供來源和鑒定信息，并自行復(fù)核。
4、人員培訓(xùn)：所有接觸細(xì)胞培養(yǎng)的人員必須接受嚴(yán)格的無菌操作培訓(xùn)和交叉污染風(fēng)險意識教育，并通過考核。強調(diào)遵守SOP的重要性。
5、清潔消毒：定期徹底清潔消毒生物安全柜、培養(yǎng)箱、工作臺面、水浴鍋、離心機等設(shè)備。培養(yǎng)箱內(nèi)的水盤要定期清潔消毒并更換無菌水。
6、警惕"問題"細(xì)胞系：對已知易污染他系或易被污染（如一些生長緩慢的細(xì)胞）的細(xì)胞系要格外小心，實施更嚴(yán)格的隔離和操作措施。
關(guān)鍵要點總結(jié)
隔離與專用化：空間、時間、試劑、耗材盡可能專用。
無菌操作是根本 每一個動作都要考慮到避免污染的可能性（特別是氣溶膠和移液器污染）。
標(biāo)記清晰無誤：這是防止人為混淆的基礎(chǔ)。
建立并使用細(xì)胞庫：這是保證細(xì)胞來源一致性和降低長期傳代風(fēng)險的核心策略。
定期STR鑒定是金標(biāo)準(zhǔn)：絕對不能僅憑形態(tài)、生長特性或來源信息就認(rèn)為細(xì)胞沒問題。必須進行分子水平的定期鑒定。
提高意識，嚴(yán)格管理：交叉污染是實驗室管理不善和操作者意識薄弱的直接后果。需要整個團隊的高度重視和執(zhí)行力。
記?。侯A(yù)防交叉污染的成本（時間、金錢）遠低于污染發(fā)生后的代價（實驗失敗、論文撤稿、聲譽損失）。把細(xì)胞鑒定和規(guī)范操作作為實驗不可分割的一部分，而非額外的負(fù)擔(dān)。
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