ATCC菌種霍亂弧菌的檢測(cè)方法和性狀！
中國(guó)微生物菌種查詢(xún)網(wǎng) / 2018-10-24 09:21:03
霍亂弧菌檢測(cè)方法
生化鑒定
能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、半乳糖等產(chǎn)酸產(chǎn)氣，遲緩發(fā)酵乳糖。不分解阿拉伯糖、水楊素、衛(wèi)矛醇、鼠李糖、木糖、側(cè)金盞花醇和肌醇。氧化酶、明膠液化試驗(yàn)陽(yáng)性。V-P試驗(yàn)大多數(shù)EL-Tor生物型陽(yáng)性，而古典生物型大多為陰性?；魜y弧菌能分解色氨酸產(chǎn)生吲哚，同時(shí)能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽。因此當(dāng)霍亂弧菌培養(yǎng)在含硝酸鹽的蛋白胨水中，所產(chǎn)生的亞硝酸鹽與吲哚結(jié)合成亞硝基吲哚，滴加濃硫酸即出現(xiàn)薔薇色，稱(chēng)為霍亂紅試驗(yàn)陽(yáng)性 ATCC菌種 。
血清凝集法
根據(jù)弧菌O抗原不同，分成Ⅵ個(gè)血清群，第Ⅰ群包括霍亂弧菌的兩個(gè)生物型。第Ⅰ群A、B、C三種抗原成份可將霍亂弧菌分為三個(gè)血清型：含AC者為原型（又稱(chēng)稻葉型），含AB者為異型（又稱(chēng)小川型），A、B、C均有者稱(chēng)中間型（彥島型）。
1992年10月在印度東南部又發(fā)現(xiàn)了一個(gè)引起霍亂流行的新血清型菌株（0139），它引起的霍亂在臨床表現(xiàn)及傳播方式上與古典型霍亂完全相同，但不能被01群霍亂弧菌診斷血清所凝集，抗01群的抗血清對(duì)0139菌株無(wú)保護(hù)性免疫。在水中的存活時(shí)間較01群霍亂弧菌長(zhǎng)，因而有可能成為引起世界性霍亂流行的新菌株，推薦使用天津生物芯片生產(chǎn)的霍亂弧菌診斷血清。
聚合酶鏈反應(yīng)法
1、普通聚合酶鏈反應(yīng)法
核酸擴(kuò)增技術(shù)，即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chainreaction，PCR），其基本原理是設(shè)計(jì)、合成兩條寡核苷酸，作為引物，對(duì)應(yīng)于待測(cè)病原微生物某一段特異性序列的兩端，然后在體外模擬DNA體內(nèi)復(fù)制的過(guò)程反復(fù)擴(kuò)增，使靶序列放大上萬(wàn)倍甚至上百萬(wàn)倍而被檢測(cè)出來(lái)。一般選擇霍亂腸毒素(cholera enterotoxin，CT)基因ctx的保守序列作為靶基因。一些非產(chǎn)毒株(如環(huán)境來(lái)源的菌株)有可能通過(guò)基因水平轉(zhuǎn)移獲得毒力基因成為產(chǎn)毒株，若僅檢測(cè)ctx基因容易造成漏檢。因此，霍亂弧菌的其他重要基因，如毒力協(xié)同調(diào)節(jié)菌毛A基因(tcp A)、o抗原基因(rfb)、外膜蛋白基因(omp)以及毒力表達(dá)調(diào)控基因(toxR)等也被選用為PcR的靶基因，這大大提高了檢測(cè)的特異度.
2、多重PCR法
與常規(guī)PCR相比，多重PCR一次反應(yīng)可檢測(cè)多個(gè)基因，節(jié)省了時(shí)間和成本。國(guó)內(nèi)、外許多學(xué)者選用霍亂弧菌的毒素基因ctx、tcp與其他基因如ompW、rfb、hly進(jìn)行組合，作為共同的靶基因，克服了由于毒力基因特異度不夠高而造成的假陽(yáng)性。多重PcR同時(shí)可準(zhǔn)確區(qū)分不同血清型的霍亂弧菌和快速鑒定其是否為產(chǎn)毒株，可謂一舉多得，大大提高了檢測(cè)效率。
3、熒光定量PCR法
熒光定量PCR自動(dòng)化程度高、特異性強(qiáng)、無(wú)交叉污染，在霍亂弧菌的快速診斷中得到廣泛應(yīng)用。尤其是近年來(lái)，隨著引物與探針的設(shè)計(jì)更精確、多通道熒光PCR儀的開(kāi)發(fā)與廣泛使用，多重?zé)晒舛縋CR技術(shù)日臻成熟，并以其高通量、低成本、高效率等優(yōu)點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于病毒、細(xì)菌、真菌等多種病原體的快速檢測(cè)，成為應(yīng)用的熱點(diǎn).
基因芯片
與PCR方法相比，基因芯片技術(shù)能同時(shí)獲得更多病原學(xué)、生物學(xué)方面的信息，從而更為全面地分析、掌握病原微生物的特征。Vora等[12]運(yùn)用基因芯片技術(shù)對(duì)多種致病性弧菌的毒力、毒素、耐藥基因及潛在的毒力基因進(jìn)行全面分析，對(duì)掌握這些細(xì)菌的致病性及進(jìn)行有效預(yù)防、控制等具有重要意義。但基因芯片成本較高，距離推廣應(yīng)用尚需時(shí)間等待。
性狀
形態(tài)與培養(yǎng)特性
新從病人分離出古典型霍亂弧菌和ELtor弧菌比較典型，為革蘭氏陰性菌，菌體彎曲呈弧狀或逗點(diǎn)狀，菌體一端有單根鞭毛和菌毛，無(wú)莢膜與芽胞。經(jīng)人工培養(yǎng)后，易失去弧形而呈桿狀。取霍亂病人米泔水樣糞便作活菌懸滴觀(guān)察，可見(jiàn)細(xì)菌運(yùn)動(dòng)極為活潑，呈流星穿梭運(yùn)動(dòng)。在液體培養(yǎng)基內(nèi)常呈單個(gè)、成對(duì)成鏈狀，有的相連呈S形，甚至螺旋狀。
營(yíng)養(yǎng)要求不高，在PH8.8～9.0的堿性蛋白胨水或平板中生長(zhǎng)良好。因其他細(xì)菌在這一PH不易生長(zhǎng)，故堿性蛋白胨水可作為選擇性增殖霍亂弧菌的培養(yǎng)基。在堿性平板上菌落直徑為2mm,圓形，光滑，透明。
霍亂弧菌能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，靛基質(zhì)反應(yīng)陽(yáng)性，當(dāng)培養(yǎng)在含硝酸鹽及色氨酸的培養(yǎng)基中，產(chǎn)生靛基質(zhì)與亞硝酸鹽，在濃硫酸存在時(shí)，生成紅色，稱(chēng)為霍亂紅反應(yīng)，但其他非致病性弧菌亦有此反應(yīng)，故不能憑此鑒定霍亂弧菌。EL Tor型霍亂弧菌與古典型霍亂弧菌生化反應(yīng)有所不同。前者Vp陽(yáng)性而后者為陰性。前者能產(chǎn)生強(qiáng)烈的溶血素，溶解羊紅細(xì)胞，在血平板上生長(zhǎng)的菌落周?chē)霈F(xiàn)明顯的透明溶血環(huán)，古典型霍亂弧菌則不溶解羊紅細(xì)胞。個(gè)別EL Tor型霍亂弧菌株亦不溶血。
抗原性
根據(jù)弧菌O抗原不同，分成Ⅵ個(gè)血清群，第Ⅰ群包括霍亂弧菌的兩個(gè)生物型。第Ⅰ群A、B、C三種抗原成份可將霍亂弧菌分為三個(gè)血清型：含AC者為原型（又稱(chēng)稻葉型），含AB者為異型（又稱(chēng)小川型），A、B、C均有者稱(chēng)中間型（彥島型）。
抵抗力
霍亂弧菌古典生物型對(duì)外環(huán)境抵抗力較弱，EL-Tor生物型抵抗力較強(qiáng)，在河水、井水、海水中可存活1～3周，在鮮魚(yú)，貝殼類(lèi)食物上存活1～2周。
霍亂弧菌對(duì)熱，干燥，日光，化學(xué)消毒劑和酸均很敏感，耐低溫，耐堿。濕熱55℃，15分鐘，100℃，1～2分鐘，水中加0.5ppm氯15分鐘可被殺死。0.1%高錳酸鉀浸泡蔬菜、水果可達(dá)到消毒目的。在正常胃酸中僅生存4分鐘。