阪崎腸桿菌在牛奶中的檢測(cè)方法-ATCC菌種
中國(guó)微生物菌種查詢網(wǎng) / 2018-10-15 10:37:30
阪崎腸桿菌在牛奶中的檢測(cè)方法-ATCC菌種
阪崎腸桿菌是乳制品中近幾年新發(fā)現(xiàn)的一種致病菌。它是存在自然環(huán)境中的一種“條件致病菌”，已被世界衛(wèi)生組織和許多國(guó)家確定為引起嬰幼兒死亡的重要條件致病菌，可導(dǎo)致任何年齡層人群的疾病，尤其是對(duì)早產(chǎn)兒、出生體重輕的嬰兒或免疫受損嬰兒的威脅最大，嚴(yán)重者可導(dǎo)致敗血癥、腦膜炎或壞死性小腸結(jié)腸炎。繼美國(guó)FDA2002年在本土某一些國(guó)際乳業(yè)巨頭生產(chǎn)的嬰兒配方奶粉中檢出阪崎腸桿菌后，2003年又一家國(guó)際乳業(yè)巨頭公司主動(dòng)召回在美國(guó)生產(chǎn)的一批檢出極微量阪崎腸桿菌的罐裝早產(chǎn)兒特殊配方奶粉，此后成為世界關(guān)注的焦點(diǎn)。中國(guó)在2005年5月通過(guò)《奶粉中阪崎腸桿菌檢測(cè)方法》行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的審定，對(duì)奶粉嚴(yán)查此菌。
一、阪崎桿菌的生物學(xué)特性
1 形態(tài)染色
阪崎腸桿菌屬腸桿菌科腸桿菌屬 , 因此本菌具備腸桿菌基本形態(tài)特征 : 革蘭陰性粗短桿菌，有周身菌毛 , 無(wú)芽胞, 有動(dòng)力 。
2 培養(yǎng)特性
能在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂、血平板、麥康凱(MAC) 瓊脂、伊紅美蘭 (EMB) 瓊脂、脫氧膽酸瓊脂等多種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖。培養(yǎng)最佳溫度 25 ～ 36 ℃ , 在 6～ 45 ℃下都能生長(zhǎng) , 某些菌株可在 47 ℃下生長(zhǎng) 。在胰蛋白胨瓊脂 (TSA) 、腦心浸液瓊脂(BH I) 及血平板上經(jīng) 25 ～ 36 ℃培養(yǎng) 24 h 后 , 形成 1. 5 ～ 2. 5mm, 黃色菌落。在結(jié)晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂 (VRBG) 能產(chǎn)生紫紅色菌落。
二、阪崎桿菌的傳統(tǒng)檢測(cè)方法
1 基本步驟如下：
取檢樣100g（mL）加入已預(yù)熱至44℃裝有900mL緩沖蛋白胨水的錐形瓶中，用手緩緩地?fù)u動(dòng)至充分溶解，36℃±1℃培養(yǎng)18 h±2h。移取1mL轉(zhuǎn)種于10mL mLST-Vm肉湯，44℃±0.5 ℃培養(yǎng)24 h±2h。
輕輕混勻mLST-Vm 肉湯培養(yǎng)物，各取增菌培養(yǎng)物1環(huán)，分別劃線接種于兩個(gè)阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基平板，36℃±1℃培養(yǎng)18 h±2 h。
挑取1 個(gè)～5 個(gè)可疑菌落，劃線接種于TSA平板。25℃±1℃培養(yǎng)48 h±4 h。 自TSA 平板上直接挑取黃色可疑菌落，進(jìn)行生化鑒定。阪崎腸桿菌的主要生化特征見(jiàn)表 1?？蛇x擇生化鑒定試劑盒或全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)。
2 結(jié)果與報(bào)告
綜合菌落形態(tài)和生化特征，報(bào)告每100g（mL）樣品中檢出或未檢出阪崎腸桿菌。
3 注意事項(xiàng)
（1）取樣前應(yīng)對(duì)樣品包裝的開啟處和取樣勺進(jìn)行消毒
（2）檢測(cè)樣品不能低于333g
三、檢測(cè)新技術(shù)簡(jiǎn)介
1、 對(duì)硝基酚光電比色法
利用阪崎腸桿菌的α-葡萄糖苷酶活性 , 分解對(duì)硝基酚-α- D -葡萄糖苷底物 , 釋放黃色的對(duì)硝基酚 , 在 405 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度 , 根據(jù)吸光度的大小 , 確定樣品中阪崎腸桿菌是否存在。方法是常規(guī)增菌 , 在 VRBG 或 TSA 平板上挑取可疑菌落 , 制備成一定濃度的菌懸液與底物混勻 , 37 ℃ 4 h 后進(jìn)行比色測(cè)定[4]。
2、熒光定量 PCR 方法
熒光定量 PCR 技術(shù)的基本原理是在PCR 反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán) , 該基團(tuán)是一對(duì)合適的熒光物質(zhì) , 可以構(gòu)成一個(gè)能量供體和能量受體對(duì) , 其中供體的發(fā)射光譜和受體的吸收光譜重疊 , 在 PCR 反應(yīng)基因擴(kuò)增時(shí) , 激發(fā)供體而釋放的熒光能量正好被受體吸收 , 使得供體的熒光強(qiáng)度減弱而受體熒光強(qiáng)度增強(qiáng) , 利用熒光信號(hào)強(qiáng)弱變化積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè) PCR 反應(yīng)過(guò)程 , 最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析。
實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)已廣泛應(yīng)用于多種食品微生物污染的檢測(cè)。 SEO 等利用阪崎腸桿菌部分大分子合成(MMS) 操縱子基因序列建立了奶粉中阪崎腸桿菌的實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 方法 , 能檢測(cè)到 0.6-1g 奶粉中的阪崎腸桿菌 , 且比傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測(cè)時(shí)間從 6 ～ 7 天縮短至 2 天內(nèi)完成。對(duì) 68株阪崎腸桿菌和 55 株非阪崎菌進(jìn)行檢測(cè) , 未出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性 , 具有很好的特異性。
3、熒光法選擇性培養(yǎng)基法
該方法也是利用α-葡萄糖苷酶活性的檢測(cè)方法[3]。在營(yíng)養(yǎng)瓊脂基礎(chǔ)上添加4 -甲基-傘形酮-α- D -葡萄糖苷 (α-MUG) 。阪崎腸桿菌在該培養(yǎng)基上形成黃色菌落 , 在紫外光照射下發(fā)生熒光。該法靈敏度和特異性都比較好 , 已在多個(gè)國(guó)家開展使用 , 均取得穩(wěn)定可靠的結(jié)果。