范圍
本標準規(guī)定了食品中金黃色葡萄球菌（ATCC菌種）的檢驗方法。
本標準適用于各類食品和食物中毒樣品中金黃色葡萄球菌的檢驗。
一、設(shè)備和材料
1、冰箱：0℃～4℃。
2、恒溫培養(yǎng)箱；36℃士1℃。
3、顯微鏡：10*——100*。
4、均質(zhì)器或滅菌乳缽。
5、架盤藥物天平：0g——5009，精確至0.59。
6、滅菌試管：10mm*100mm、16mm*160mm。
7、滅菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）.
8、滅菌錐形瓶：500mL、100mL。
9、滅菌培養(yǎng)皿：直徑90mm。
10、注射器：0.5mL。
11、滅菌L型涂布棒。
12、滅菌刀、剪子、鑷子等。
二、培養(yǎng)基和試荊
1、胰酪臟大豆肉湯：按GB/T4789.28一2003中4.59規(guī)定。
2、 7.5％氯化鈉肉湯：按GB/T4789.28一2003中4.61規(guī)定。
3、血瓊脂平板：按GB/T4789.28一2003中4.6規(guī)定。
4、 Baird一Parker瓊脂平板：按GB/T4789.28一2003中4.60規(guī)定。
5、肉浸液肉湯：按GB/T4789.28一2003中4.1規(guī)定。
6、 0.85％滅菌生理鹽水。4.7兔血漿：按GB/T4789.28一2003中4.63規(guī)定。
三、操作步驟
1、增菌培養(yǎng)法
（1）檢樣處理：按無菌操作取檢樣25g(ml），加入225mL滅菌生理鹽水，固體樣品研磨或置均質(zhì)器中制成混懸液。
（2）增菌及分離培養(yǎng)：吸取5ml上述混懸液，接種于7.5%氯化鈉肉湯或胰酪陳大豆肉湯50mL培養(yǎng)基內(nèi)，36℃士1℃培養(yǎng)24h，轉(zhuǎn)種血平板和Baird一Parker平板，36℃士1℃培養(yǎng)24h，挑取血平板上金黃色（有時為白色）菌落進行革蘭氏染色鏡檢及血漿凝固酶試驗。
（3）形態(tài)：本菌為革蘭氏陽性球菌，排列呈葡萄球狀，無芽胞，無莢膜，致病性葡萄球菌菌體較小，直徑約為0.5um～1um。
（4）在肉湯中呈混濁生長，在胰酩膝大豆肉湯內(nèi)有時液體澄清，菌量多時呈混濁生長，血平板上菌落呈金黃色，有時也為白色，大而突起、圓形、不透明、表面光滑，周圍有溶血圈。在Baird一Parker平板上為圓形、光滑凸起、濕潤、直徑為2mm——3mm，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明圈。用接種針接觸菌落似有奶油樹膠的硬度，偶然會遇到非脂肪溶解的類似菌落；但無混濁帶及透明圖。長期保存的冷凍或干燥食品中所分離的菌落比典型菌落所產(chǎn)生的黑色較淡些，外觀可能粗糙并干燥。
（5）血漿凝固酶試驗：吸取1：4新鮮兔血漿O.5mL，放入小試管中，再加人培養(yǎng)24h的金黃色葡萄球菌肉浸液肉湯堵養(yǎng)物0.5mL，振蕩搖勻，置36℃士1℃溫箱或水浴內(nèi)，每半小時觀察一次，觀察6h,如呈現(xiàn)凝固，即將試管傾斜或倒置時，呈現(xiàn)凝塊者，被認為陽性結(jié)果。同時以已知陽性和陰性葡萄球菌株及肉湯作為對照。
2、直接計數(shù)方法6.2.1吸取上述1：10混懸液，進行10倍遞次稀釋，根據(jù)樣品污染情況，選擇不同濃度的稀釋液1mL，分別加人三塊Baird一Parker平板，每個平板接種量分別為0.3mL、0.3mL、0.4mL，然后用滅菌L棒涂布整個平板。如水分多不易吸收，可將平板放在36℃士1℃ lh，等水分蒸發(fā)后反轉(zhuǎn)平皿置36℃士1℃培養(yǎng)．
在三個平板上點數(shù)周圍有混濁帶的黑色菌落，并從中任選五個菌落，分別接種血平板，36℃士1℃ 24h培養(yǎng)后進行染色鏡檢、血漿凝固酶試驗，步驟同增菌培養(yǎng)法。
3、菌落計數(shù)：將三個平板中疑似金黃色葡萄球菌黑色菌落數(shù)相加，乘以血漿凝固酶陽性數(shù)，除以5，再乘以稀釋倍數(shù)，即可求出每克樣品中金黃色葡萄球菌數(shù)。
附錄A（規(guī)范性附錄）葡萄球菌腸毒素檢驗
A.1設(shè)備和材料A.1.1冰箱：0℃～4℃．
A.1.2恒溫培養(yǎng)箱：36℃士1℃。
A.1.3振蕩培養(yǎng)箱或普通培養(yǎng)箱：36℃士1℃。
A.1.4酶標儀。
A.1.5離心機：8OO0r/min。
A.1.6均質(zhì)器或滅菌乳缽。
A.1.7層析柱：40mm*（20mm——25mm）。
A.1.8微量加樣器：200uL、50uL。
A.1.9細滴管。
A,1.10分液漏斗。
A.1.11透析袋．
A.1.12洗瓶。
A.1.13滅菌吸管：1mL（具0.0lmL刻度）、10mL（具O.lmL刻度）.
A.1.14滅菌培養(yǎng)皿：直徑150mm（或帶蓋搪瓷盤）。
A.1.15滅菌錐形瓶；250mL。
A.1.16有機玻璃模板。
A.1.17打孔器：直徑2.5mm。
A.1.18載玻片、橡皮圈。
A.1.19滅菌玻璃紙、三角棒、鑷子等A.2培養(yǎng)基和試劑
A.2.1腸毒素產(chǎn)毒培養(yǎng)基：按GB/T4789.28一2003中4.86規(guī)定。
A.2.2營養(yǎng)瓊脂：按GB/T4789.28一2003中規(guī)定。
A.2.3 1％瓊脂糖（0.9％生理鹽水配制）溶液。
A.2.4 0.2mol/L pH7.5磷酸鹽緩沖液。
A.2.5三氯甲烷。
A.2.6 6mol／毛鹽酸溶液。
A.2.7 5mol/L氫氧化鈉。
A.2.8 0.85％生理鹽水。
A.2.9 1％乙酸溶液。
A.2.10 0.1％噬嗦紅R或氨基黑B。
A.2.11硅膠或凡士林。
A.2.12A、B、C、D型葡萄球菌腸毒素和抗血清。
A.2.13羧甲基纖維素（CM22或CMllWhatrnan）。
A.2.14 0.2mol/LpH6.8磷酸鹽緩沖液。
A.2.15酶標記A、B、C、D腸毒素抗血清或醉聯(lián)免疫試劑盒。
A.2.16 0.1mol/L pH9.5碳酸鹽緩沖液．
A.2.17 0.05%0.02mol/L pH7.2吐溫-20緩沖液。
A.2.18鄰苯二胺酶底物。A.2.19 2mol/L硫酸。
A.3檢驗程序
A.3.1從菌株中檢測腸毒素從菌株中檢測腸毒素程序見圖A.1（略）。
A.3.2從食物檢樣中提取和檢測腸毒素
A.3.2.1微玻片法檢測腸毒素（濃縮法和層析法）程序見圖A.2（略）。
A.3.2.2酶聯(lián)免疫法檢測腸毒素程序見圖A.3（略）。
A.4腸毒素檢測
A.4.1從菌株中提取腸毒素方法
A.4.1.1液體透析培養(yǎng)法：用寬2.5cm、長80cm的透析袋裝入60mL產(chǎn)毒培養(yǎng)基，兩端扎緊，將透析袋裝入250ml錐形瓶內(nèi)，加人15mL滅菌生理鹽水，透析袋兩端留在瓶口，用棉塞塞好，121℃高壓滅菌30min，待測菌株接種曹養(yǎng)瓊脂斜面（試管18mm*180mm),37℃培養(yǎng)24h，用5mL生理鹽水洗下菌落，傾人上述培養(yǎng)瓶中，每個菌種種一瓶，37℃振蕩培養(yǎng)48h，振速為100次／min，吸出菌液離心，8000r/min3Omin，取上清液做雙相瓊脂擴散，如為陰性，再裝入透析袋內(nèi)，用電風(fēng)扇吹，或用多聚乙二醇，濃縮至1mL-2mL，再做瓊脂擴散。A.4.1.2固體透析培養(yǎng)法：向直徑150mm的滅菌平皿或帶蓋搪瓷盤中傾人滅菌產(chǎn)毒培養(yǎng)基約100mL——120ml，凝固后表面鋪一滅菌玻璃紙，待測菌株接種在營養(yǎng)瓊脂上，37℃培養(yǎng)24h，用約3mL滅菌鹽水洗下菌苔，傾在玻璃紙上，用滅菌三角棒涂滿平皿，37℃培養(yǎng)48h，加人10mL——20mL滅菌生理鹽水，用滅菌三角棒刮取菌苔，吸取菌液離心，以下步驟同液休透析培養(yǎng)法。
A.4.2從食品中提取腸毒素方法
A.4.2.1直接濃縮法：取食品樣品100g，加入無菌0.2mol/L pHI7.5磷酸鹽緩沖液，均質(zhì)成勻漿，置4℃浸泡18h——24h，用紗布過濾將濾液離心8000r/min 20min．取上清液，放入分液漏斗中，加人10ml三氯甲烷，振搖10min，靜置，將底層三氯甲烷棄去（如不分層，可8ooor/min離心20min）。加人6mol/l鹽酸溶液調(diào)pH至4.5,8O00r／min離心20min，取上清液，加5mol/L氫氧化鈉溶液，調(diào)pH至7.5，離心取上清液，裝入透析袋或玻璃紙，用電扇吹干，或放多聚乙二醇濃縮至1mL——2mL，做微玻片雙向瓊脂擴散。
A.4.2.2層析法：如需提取較純腸毒素，可將上述濃縮液用蒸餾水洗下，裝入透析袋，以0.008mol/L pH5.6磷酸鹽緩沖液平衡，加人CM層析柱內(nèi)，流速lmL/min——2mL/min，用0.008mol/LpH5.6磷酸鹽緩沖液洗脫，再用0.2mol/L pH6.8磷酸鹽緩沖液洗脫出腸毒素。洗脫液裝人透析袋內(nèi)，用電扇或多聚乙二醇濃縮至1mL，做微玻片雙向瓊脂擴散，檢測腸毒素。
A.4.3雙向瓊脂擴散檢測腸毒素
A.4.3.1微玻片法：將在95％乙醇中浸泡的載片用潔凈紗布擦千，吸取溶化的0.2％瓊脂糖（蒸餾水配制）滴在載玻片上，使剩余的瓊脂糖流下，放在無塵的環(huán)境中干燥，先將一層薄塑料板放在載玻片上，然后將帶孔的有機玻璃模板邊緣涂一層薄的硅膠或凡士林，放在塑料板上，兩邊用橡皮圈系緊固定，吸取1%瓊脂糖，立即從模板中間孔加人載玻片和模板之間，直至充滿瓊脂糖，凝固后再將孔中瓊脂糖用注射器針頭挑去，在中間孔滴加抗血清，四周滴加菌株產(chǎn)毒液或食品提取液，放人加有濕棉球的容器內(nèi)，放25℃一30℃、18h——24h觀察結(jié)果?？稍跓艄馍希χ档谋尘坝^察，在抗血清和提取液之間呈現(xiàn)明顯沉淀線。如沉淀線只能微弱可見時，可進行染色。
A.4.3.2玻片法：吸取溶化的1%瓊脂糖2.5mL，鋪在潔凈載玻片上．凝固后用直徑2.5mm的金屬打孔器打成幅射型，孔距為2.5mm，中心孔加人腸毒素抗血清，周圍六個孔加人菌株或食品的腸毒素提取液，放入有滴加2/10000三氮化鈉濕棉球的容器內(nèi)，以保持濕度。置25℃～30℃、18h-20h，觀察結(jié)果，在抗血清的提取物之間有明顯沉淀線即為陽性。
A.4.3.3染色法；用微玻片法取下膠帶和有機玻璃摸板，玻片法可直接將玻片放人蒸餾水中浸泡4h-5h，中間換2次～3次水，在下述各液中浸10min，10％乙酸中含1％唾嚓紅R（或氨基黑）；1％乙酸；1％乙酸含l％甘油，如脫色不凈，可繼續(xù)浸泡。取出后蓋一濾紙，吸去多余液體，在室溫或35℃烘干。陽性者沉淀被染上顏色，可長期保存．
A.4.4酶聯(lián)免疫法檢測腸毒素（雙抗體法）
A.4.4.1包被抗體：用0.1m1/L pH9.5碳酸鹽緩沖液稀釋腸毒素抗血清使成5ug/mL，加人洗凈的苯乙烯凹孔板內(nèi)，每孔0.2mL，置36℃士1℃30min，棄去上液。
A.4.4.2洗滌：用0.05％ 0.02mol/L pH7.2吐溫-20緩沖液洗滌五次。
A.4.4.3加人檢樣：如為液體，可直接加人0.2mL，固體樣品取100g，加人0.2mol/LpH7.5磷酸鹽緩沖液100ml，均質(zhì)后取過濾液0.2mL。A.4.4.4洗滌：同A.4.4.2。
A.4.4.5每孔內(nèi)加人酶抗體0.2ml，置36℃士1℃30min，同時做陽性和陰性對照。棄去上液。
A.4.4.6洗滌：同A.4.4.2.
A.4.4.7每孔內(nèi)加人鄰苯二胺酶底物溶液0.2mL，室溫放置加而饑A.4.4.5每孔內(nèi)加人2mol/L硫酸0.05mL，立即放酶標儀比色。
A.4.4.9結(jié)果判定：樣品OD值比陰性對照，比值大于2為陽性，小于2為陰性。