（Escherichia coli）大腸桿菌的轉(zhuǎn)化實(shí)驗！-ATCC菌種
中國微生物菌種查詢網(wǎng) / 2018-10-10 10:45:57
（Escherichia coli）大腸桿菌的轉(zhuǎn)化實(shí)驗！-ATCC菌種
實(shí)驗器材
旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，1.5ml 微量離心管，雙面微量離心管架，干式恒溫氣浴(或恒溫水浴鍋)，制冰機(jī)，恒溫?fù)u床，培養(yǎng)皿(已鋪好固體LB-Amp)，超凈工作臺，酒精燈，玻璃涂棒，恒溫培養(yǎng)箱。
培養(yǎng)基及試劑
培養(yǎng)基(不加抗菌素)，LB培養(yǎng)基(加抗菌素)，無菌ddH2O，IPTG，X-gal.
實(shí)驗原理
質(zhì)粒DNA粘附在細(xì)菌細(xì)胞表面，經(jīng)過42°C短時間的熱擊處理，促進(jìn)吸收DNA.然后在非選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)一代，待質(zhì)粒上所帶的抗菌素基因表達(dá)，就可以在含抗菌素的培養(yǎng)基中生長。
操作步驟
(1)事先將恒溫水浴的溫度調(diào)到42℃。
(2)從-70℃ 超低溫冰柜中取出一管(100μl)感受態(tài)菌，立即用手指加溫融化后插入冰上，冰浴5~10min。
(3) 加入5μl連接好的質(zhì)粒混合液(DNA含量不超過100ng)，輕輕震蕩后放置冰上20min。
(4) 輕輕搖勻后插入42℃水浴中1~2min進(jìn)行熱休克，然后迅速放回冰中，靜置3~5min。
(5) 在超凈工作臺中向上述各管中分別加入500μl LB培養(yǎng)基(不含抗菌素)輕輕混勻，然后固定到搖床的彈簧架上37℃震蕩1h.
(6) 在超凈工作臺中取上述轉(zhuǎn)化混合液100~300μl，分別滴到含合適抗菌素的固體LB平板培養(yǎng)皿中，用酒精燈燒過的玻璃涂布棒涂布均勻(注意：玻璃涂布棒上的 酒精熄滅后稍等片刻，待其冷卻后再涂)。
(7) 如果載體和宿主菌適合藍(lán)白斑篩選的話，滴完菌液后再在平板上滴加40μl 2% X-gal，8μl 20% IPTG，用酒精燈燒過的玻璃涂布棒涂布均勻。
(8) 在涂好的培養(yǎng)皿上做上標(biāo)記，先放置在37℃恒溫培養(yǎng)箱中30-60min直到表面的液體都滲透到培養(yǎng)基里后，再倒置過來放入37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜。
(9) 在被細(xì)菌污染的桌面上噴灑70%乙醇，擦干桌面，寫實(shí)驗報告。
(10)觀察平板上長出的菌落克隆，以菌落之間能互相分開為好。注意白色菌斑。