嗜酸乳桿菌的生長曲線和耐酸你的測定結果-ATCC菌種
中國微生物菌種查詢網 / 2018-09-28 11:36:32
嗜酸乳桿菌不僅在胃中，它還是人體小腸內的主要益生菌。 在胃中能存活的致病菌的胃部是個小型"消毒車間"，這是由于胃液具有很強的酸性。嗜酸乳桿菌屬于乳桿菌屬，革蘭氏陽性桿菌，桿的末端呈圓形，主要存在小腸中，釋放乳酸，乙酸和一些對有害菌起作用的抗菌素，但是抑菌作用比較弱。
由于嗜酸乳桿菌多以發(fā)酵乳制品作為載體，而發(fā)酵過程中產生的乙酸和乳酸使得乳制品本身具有較低的pH 值 （pH 值為4.5～5.0）；另外，在食用這些發(fā)酵乳制品的時候還要經過胃液的低酸性環(huán)境。胃液pH 值因飲食結構不同波動很大，通常約為3.0。人每天可以分泌大約2.5L 胃液，空腹時胃液的pH 為1.5，在進食后逐漸上升到3.0～5.0。食物在胃中停留的時間為1～2h。以上這些酸脅迫的存在，會影響嗜酸乳桿菌的存活率，進而影響其在腸道中的進一步定植和生理保健功效的發(fā)揮。因而，研究嗜酸乳桿菌對模擬胃酸pH 值的耐受性，判斷該菌能否順利過胃而起到益生作用，就具有重要的現(xiàn)實意義。
材料和方法
1、材料
菌株來源 ：嗜酸乳桿菌 （Lactobacillus acidophilus），代號為ATCC4356；La-IM1、La-IM2 和La-IM3 分離自內蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品。
儀器設備 ：紫外分光光度計、光學顯微鏡 （OLMPUS ）、梅特勒—托利多Delta320pH 計、電熱手提式壓力蒸汽滅菌器、恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺等。
培養(yǎng)基 ：RS培養(yǎng)基[9]:5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L牛肉膏，20g/L葡萄糖，2g/L K HPO ，2g/L檸檬酸二銨，5g/L 乙酸鈉，0.58g/L MgSO .7H2O ，0.25g/L MnSO .4H2O, 調pH6.2～6.4，固體需加15g/L瓊脂粉，121℃滅菌15min。
2、方法
菌種的活化與分純
用接種環(huán)挑取少量冷凍干燥保藏的菌粉，接種于液體MRS 培養(yǎng)基中37℃，24h培養(yǎng)，連續(xù)傳代兩次進行活化；將活化后的菌種于MRS 固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，37℃，48h 培養(yǎng)；挑取半個單菌落染色鏡檢，如果鏡檢未發(fā)現(xiàn)雜菌，則用接種環(huán)挑取另外半個單菌落接種于液體MRS 培養(yǎng)基中培養(yǎng)并保存?zhèn)溆?；如果鏡檢發(fā)現(xiàn)雜菌，則用接種環(huán)挑取單菌落于MRS 固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，再鏡檢，直至分純。
株菌酸耐受性的實驗
將4 株嗜酸乳桿菌以3% 的接種量接種于MRS 液體培養(yǎng)基中進行傳代一次。用鹽酸調節(jié)MRS 液體培養(yǎng)基的pH 值為2.5，吸取4.5mL 于4 個試管中，置于高壓滅菌鍋內進行121℃、15min滅菌。按照 10%的添加量吸取500 μL菌液分別加入到4個試管中作用3h。作用結束后，將試管在漩渦混勻器上進行震蕩混勻，平板涂布進行活菌計數(shù)。
嗜酸乳桿菌La-IM2生長曲線的測定
將嗜酸乳桿菌La-IM2 按3％的接種量，接種到裝有300mL液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，37℃進行培養(yǎng)。每隔2h在無菌超靜工作臺中取出20mL 用于測OD600 和pH 值，直至24h，然后繪制生長曲線。
嗜酸乳桿菌La-IM2在不同pH值條件下的酸耐受性實驗
用鹽酸調節(jié)PBS緩沖液的pH值分別為 1.5、2.5、3.5、4.5、7，然后將嗜酸乳桿菌La-IM2 按 10％的接種量接種于以上pH 值的PBS 緩沖液中，在37℃下進行作用，作用時間分別為1.5h和3h，隨后將試管在漩渦混勻器上進行震蕩混勻，平板涂布進行活菌計數(shù)。
活菌計數(shù)方法
每個樣品取3 個平行，用PBS 緩沖液 （pH 7）逐步稀釋5個梯度。以MRS 固體培養(yǎng)基為計數(shù)培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)48～72h后平板計數(shù)[10]，選擇平板上菌落數(shù)在30～300個菌落的平板，統(tǒng)計菌落數(shù)，最后求取平均值。
結果與討論
株嗜酸乳桿菌的耐酸力評價
4株嗜酸乳桿菌菌株ATCC4356、La-IM1、La-IM2和La-IM3在pH2.5 的PBS 緩沖液中作用3h 后的活菌數(shù)分別為：2.92 ×108、1.2 ×108、1.13 ×109和 1.18 ×108 CFU/mL，存活率分別為：73.92%、70.91%、102.72%和83.69%。活菌數(shù)均大于108CFU/mL，存活率均高于60%，證明4 株嗜酸乳桿菌在pH 為2.5 的條件下酸耐受性較好，其中菌株La-IM2 的酸耐受性最高。 另外，菌株La-IM2 的存活率超過100%，原因可能是該菌株來自于開菲爾粒，而開菲爾粒的發(fā)酵酸度很高，該菌株經過長期低pH 值的酸適應后，菌株的酸耐受性進一步增加，因而變得較另外3株嗜酸乳桿菌菌株更為耐酸；其次，本實驗采用MRS 液體培養(yǎng)基調節(jié)pH 值作為菌株的酸耐受基質，使得較耐酸的該菌株可以在其中繼續(xù)生長，菌液濃度進一步升高，存活率超過 100%。
嗜酸乳桿菌La-IM2 的生長曲線的測定結果
嗜酸乳桿菌La-IM2的生長曲線可知，在2h的時候該菌即可進入對數(shù)期生長，在10h后開始進入穩(wěn)定期。隨著培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)基中的pH值逐漸降低，24h后降低為3.6，這說明該菌生長速率較快，產酸能力較強，適合于作益生菌菌株。
嗜酸乳桿菌La-IM2在不同pH 條件下的酸耐受性評價結果
嗜酸乳桿菌La-IM2在pH 1.5、pH 2.5、pH 3.5、pH 4.5、pH 7.2條件下作用1.5h后的活菌數(shù)分別為1.42 ×106、2.96 ×108、5.45 ×108、3.85 ×108、3.95×108CFU/mL；在3h后的活菌數(shù)分別為0、2.92 ×108、4.80 ×108、4.15 ×108、3.60 ×108 CFU/mL。該菌在pH 1.5 時培養(yǎng)3h后幾乎沒有活菌的存在，而培養(yǎng) 1.5h后的活菌數(shù)仍然在 106CFU/mL 以上，且其他作用條件下的活菌數(shù)均在108CFU/mL 以上，證明該菌株酸耐受性非常好。
通過模擬胃酸pH 值條件下的酸耐受性實驗，證明嗜酸乳桿菌可以以較高的活菌數(shù)順利過胃，進而起到益生菌的作用（國際乳品聯(lián)合會IDF推薦益生菌濃度＞ 107CFU/g 時能順利到達小腸并發(fā)揮益生作用）。但是，由于時間原因，本實驗只對嗜酸乳桿菌La-IM2 在模擬胃酸pH 條件下的耐受性進行了評價，沒有對其在模擬胃液環(huán)境下的存活率進行測定，因而不能完全說明該菌可以以較高的活菌數(shù)過胃。還需要進一步實驗，以測定其在模擬胃液環(huán)境下的活菌數(shù)，最終證實其是否具有益生功效。
結 論
（1）4株嗜酸乳桿菌ATCC4356、La-IM1、La-IM2和La-IM3 在pH2.5 ，3h 條件下的酸耐受性較高，活菌數(shù)均大于108CFU/mL，存活率均高于60%。其中菌株La-IM2 的酸耐受性最高，活菌數(shù)達到 1.13 ×109 CFU/mL。
（2）嗜酸乳桿菌La-IM2滿足典型的對數(shù)生長曲線規(guī)律，在2h 時該菌進入對數(shù)期生長，10h后進入穩(wěn)定期。說明該菌生長速率很快，產酸能力較強，適合于用作益生菌菌株。
（3）嗜酸乳桿菌La-IM2雖然在pH1.5 時作用3 小時后活菌數(shù)為0，但是在其他作用條件下的活菌數(shù)均在 108CFU/mL以上，證明該菌株在模擬胃酸pH 條件下的耐受性較好，可以通過胃液的低酸性環(huán)境進而發(fā)揮益生功效。
本研究以內蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵制品中分離鑒定的嗜酸乳桿菌和ATCC 標準菌株為供試菌種，進行了耐酸和耐膽鹽的嗜酸乳桿菌的篩選，并對篩選菌株生長特性進行了研究，為嗜酸乳桿菌發(fā)酵食品的生產應用提供參考。