ATCC菌種雙歧桿菌Y1-4A-01 [CCRC 910051]的檢驗
中國微生物菌種查詢網(wǎng) / 2018-08-30 09:54:48
ATCC菌種雙歧桿菌是一種革蘭氏陽性、不運(yùn)動、細(xì)胞呈桿狀、一端有時呈分叉狀、嚴(yán)格厭氧的細(xì)菌屬，廣泛存在于人和動物的消化道、陰道和口腔等生境中。雙歧桿菌屬的細(xì)菌是人和動物腸道菌群的重要組成成員之一。一些雙歧桿菌的菌株可以作為益生菌而用在食品、醫(yī)藥和飼料方面。對于雙歧桿菌的檢驗可分為以下幾步。
一、 設(shè)備和材料
除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：
1 恒溫培養(yǎng)箱：36 ℃±1 ℃。
2 冰箱：2 ℃～5 ℃。
3 天平：感量0.1 g。
4 無菌試管：18 mm×180 mm、15 mm×100 mm。
5 無菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器及配套吸頭。
6 無菌培養(yǎng)皿：直徑90 mm。
二、 培養(yǎng)基和試劑
1 甲醇：分析純。
2 三氯甲烷：分析純。
3 冰乙酸：分析純。
4 乳酸：分析純。
5 乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：吸取分析純冰乙酸5.7 mL，移入100 mL容量瓶中，加水至刻度，標(biāo)定方法見附錄B.1，此溶液濃度約為1 mol/L。
6 乳酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：吸取分析純?nèi)樗?.4 mL，移入100 mL容量瓶中，加水至刻度，標(biāo)定方法見附錄B.1，此溶液濃度約為1 mol/L。
三、 操作步驟
1 全部操作均應(yīng)遵循無菌操作程序。
2 食品用雙歧桿菌純菌菌種的鑒定及計數(shù)
接種：半固體或液體菌種直接接種在雙歧桿菌瓊脂平板。真空冷凍干燥菌種，先加適量滅菌生理鹽水，溶解菌粉，然后接種在雙歧桿菌瓊脂平板。平板在36 ℃±1 ℃厭氧培養(yǎng)48 h±2 h。
涂片鏡檢：雙歧桿菌為革蘭氏染色陽性，不抗酸、無芽孢、無動力，菌體形態(tài)多樣，呈短桿狀、纖細(xì)桿狀或球形，可形成各種分支或分叉形態(tài)。
生化鑒定：挑取5.2.1.1步驟中的平板上生長的單個菌落，進(jìn)行生化反應(yīng)檢測。雙歧桿菌的過氧化氫酶試驗為陰性。不同雙歧桿菌菌種的主要生化反應(yīng)見表1。
3 樣品的稀釋
取1.0 g固體菌種溶解于9.0 mL生理鹽水或其它稀釋液，制成1:10的樣品勻液。
用1 mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1.0 mL，沿管壁緩慢注于裝有9.0 mL稀釋液的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液），振搖試管或換用1支無菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。
另取1 mL無菌吸管或吸頭，按5.2.2.2.1操作程序，制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，即換用1次1 mL滅菌吸管或吸頭。
根據(jù)對樣品雙歧桿菌濃度的估計，選擇2個～3個適宜稀釋度的樣品勻液，在進(jìn)行10倍遞增稀釋時，吸取1.0 mL樣品勻液于無菌平皿內(nèi)，每個稀釋度做兩個平皿。同時，分別吸取1.0 mL空白稀釋液加入兩個無菌平皿內(nèi)作空白對照。
及時將 15 mL～20 mL冷卻至 46 ℃的雙歧桿菌瓊脂培養(yǎng)基（可放置于46 ℃±1 ℃恒溫水浴箱中保溫）傾注平皿，并轉(zhuǎn)動平皿使其混合均勻。
4 培養(yǎng)
待瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，36 ℃±1 ℃厭氧培養(yǎng)48 h±2 h。
5 菌落計數(shù)
可用肉眼觀察，必要時用放大鏡或菌落計數(shù)器，記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。菌落計數(shù)以菌落
形成單位（colony-forming units，CFU）表示。
選取菌落數(shù)在30 CFU～300 CFU 之間、無蔓延菌落生長的平板計數(shù)菌落總數(shù)。低于30 CFU的平板記錄具體菌落數(shù)，大于300 CFU的可記錄為多不可計。每個稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個平板的平均數(shù)。
其中一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計算半個平板后乘以2，代表一個平板菌落數(shù)。
當(dāng)平板上出現(xiàn)菌落間無明顯界線的鏈狀生長時，則將每條單鏈作為一個菌落計數(shù)。
6 食品中雙歧桿菌的鑒定及計數(shù)
稱重取樣25.0 g，或體積取樣25.0 mL，置于裝有225 mL稀釋液的滅菌錐形瓶內(nèi)，制成1:10的樣品勻液。
將上述樣品勻液接種在雙歧桿菌瓊脂平板。平板在36 ℃±1 ℃厭氧培養(yǎng)48 h±2 h。
純培養(yǎng)
挑取3個或以上的單個菌落接種于雙歧桿菌瓊脂平板。平板在36 ℃±1 ℃厭氧培養(yǎng)48 h±2 h。
四、檢驗程序
雙歧桿菌的檢驗程序見下圖：
