培養(yǎng)基滅菌處理的常用方法與操作流程及適用場(chǎng)景！
小楊 / 2025-12-04 10:10:56
培養(yǎng)基的滅菌處理是微生物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞培養(yǎng)中至關(guān)重要的環(huán)節(jié)，其核心目標(biāo)是徹底殺滅培養(yǎng)基中的所有微生物（包括細(xì)菌、真菌、芽孢、病毒等），同時(shí)最大程度保留營(yíng)養(yǎng)成分的活性。根據(jù)培養(yǎng)基成分特性、實(shí)驗(yàn)需求等，常用的滅菌方法主要分為熱力滅菌法、過(guò)濾除菌法，此外還有輻射滅菌法、化學(xué)滅菌法等輔助方式。以下詳細(xì)介紹各類方法的原理、操作流程、適用場(chǎng)景及關(guān)鍵注意事項(xiàng)：
一、熱力滅菌法
熱力滅菌法利用高溫破壞微生物的蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子結(jié)構(gòu)，使其失去活性，是應(yīng)用最廣泛的滅菌方式，根據(jù)加熱介質(zhì)不同分為高壓蒸汽滅菌法、干熱滅菌法、流通蒸汽滅菌法等。
（一）高壓蒸汽滅菌法
滅菌原理：在密閉的高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)，蒸汽壓力升高時(shí)，溫度隨之升高（壓力 0.1MPa 時(shí)，溫度可達(dá) 121℃），高溫蒸汽能快速滲透到培養(yǎng)基內(nèi)部，殺滅包括芽孢在內(nèi)的所有微生物。
適用范圍：普通微生物液體培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基（含瓊脂）、實(shí)驗(yàn)器具（如三角燒瓶、試管、培養(yǎng)皿等）。
操作流程
前期準(zhǔn)備：將配制好的培養(yǎng)基分裝到無(wú)菌容器中，瓶口塞入棉塞或硅膠塞，用牛皮紙或鋁箔紙包裹密封；將容器均勻擺放入滅菌鍋內(nèi)，確保蒸汽能自由流通，避免堆疊過(guò)密。
排氣升溫：關(guān)閉滅菌鍋門，啟動(dòng)設(shè)備，先打開排氣閥排出鍋內(nèi)冷空氣（冷空氣殘留會(huì)導(dǎo)致局部溫度不足，滅菌不徹底），待排出的蒸汽連續(xù)且無(wú)白霧時(shí)，關(guān)閉排氣閥。
恒溫滅菌：當(dāng)鍋內(nèi)壓力升至 0.1MPa、溫度達(dá)到 121℃時(shí)，開始計(jì)時(shí)，常規(guī)培養(yǎng)基滅菌 20-30 分鐘；若培養(yǎng)基體積較大（如 500mL 以上）或含大量有機(jī)物，可延長(zhǎng)至 30-40 分鐘。
冷卻泄壓：滅菌結(jié)束后，關(guān)閉電源，待鍋內(nèi)壓力自然降至常壓、溫度降至 80℃以下時(shí)，緩慢打開排氣閥，再打開鍋門取出培養(yǎng)基，冷卻后備用。
關(guān)鍵注意事項(xiàng)
必須徹底排出冷空氣，否則會(huì)出現(xiàn)“假壓力”現(xiàn)象（壓力達(dá)到設(shè)定值但溫度不足），導(dǎo)致滅菌失敗。
培養(yǎng)基分裝量不宜過(guò)多，三角燒瓶不超過(guò)容積的 1/2，試管不超過(guò) 1/3，避免滅菌時(shí)液體沸騰溢出。
含葡萄糖等易分解成分的培養(yǎng)基，需降低滅菌參數(shù)（115℃、0.06MPa，20 分鐘），或單獨(dú)滅菌后與其他成分混合。
（二）干熱滅菌法
干熱滅菌法通過(guò)高溫干燥空氣殺滅微生物，適用于耐高溫且怕潮濕的實(shí)驗(yàn)器具，較少直接用于培養(yǎng)基滅菌（僅適用于極少數(shù)耐高溫的固體成分）。
滅菌原理：在干熱環(huán)境中，微生物的蛋白質(zhì)脫水凝固、核酸降解，從而達(dá)到滅菌目的。
適用范圍：玻璃器皿（如培養(yǎng)皿、移液管）、金屬器具等；也可用于部分耐高溫的固體培養(yǎng)基成分（如瓊脂粉，需提前干燥）。
操作流程
將待滅菌物品放入干熱滅菌箱，均勻擺放，避免遮擋通風(fēng)口。
設(shè)定溫度 160-170℃，加熱 2-3 小時(shí)（若溫度升至 180℃，可縮短至 1 小時(shí)）。
滅菌結(jié)束后，關(guān)閉電源，待滅菌箱自然冷卻至室溫后，取出物品，避免高溫下打開導(dǎo)致玻璃器皿炸裂。
關(guān)鍵注意事項(xiàng)
干熱滅菌時(shí)溫度不可超過(guò) 180℃，否則會(huì)導(dǎo)致玻璃器皿變形、棉塞碳化。
待滅菌物品需干燥，避免潮濕環(huán)境影響滅菌效果。
（三）流通蒸汽滅菌法
流通蒸汽滅菌法利用 100℃的常壓蒸汽進(jìn)行滅菌，適用于含熱敏感成分且對(duì)滅菌要求不高的培養(yǎng)基。
滅菌原理：100℃的蒸汽可殺滅微生物的營(yíng)養(yǎng)體，但無(wú)法殺滅芽孢，需多次滅菌才能達(dá)到徹底滅菌效果（即間歇滅菌法）。
適用范圍：含維生素、氨基酸等熱敏感成分的培養(yǎng)基，或用于短期使用的實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基。
操作流程
將培養(yǎng)基放入流通蒸汽滅菌器或蒸籠中，加熱至 100℃，保持 30 分鐘，殺滅營(yíng)養(yǎng)體。
取出培養(yǎng)基，置于 37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 小時(shí)，使芽孢萌發(fā)為營(yíng)養(yǎng)體。
重復(fù)上述滅菌和培養(yǎng)步驟 2-3 次，直至徹底殺滅芽孢。
關(guān)鍵注意事項(xiàng)：該方法滅菌周期長(zhǎng)，僅適用于對(duì)滅菌效率要求較低的場(chǎng)景，且需嚴(yán)格控制培養(yǎng)步驟，確保芽孢完全萌發(fā)。
二、過(guò)濾除菌法
過(guò)濾除菌法通過(guò)濾膜的物理攔截作用去除微生物，不涉及高溫處理，適用于含熱敏感成分的培養(yǎng)基（如細(xì)胞培養(yǎng)基、含抗生素的培養(yǎng)基）。
滅菌原理：使用孔徑小于微生物的濾膜（常用 0.22μm，可攔截細(xì)菌、真菌等；若需去除病毒，可用 0.1μm 濾膜），通過(guò)壓力差使培養(yǎng)基通過(guò)濾膜，微生物被攔截在濾膜上，從而獲得無(wú)菌培養(yǎng)基。
適用范圍：含血清、抗生素、生長(zhǎng)因子、酶類等熱敏感成分的培養(yǎng)基，如細(xì)胞培養(yǎng)基、含青霉素的篩選培養(yǎng)基。
操作流程
前期準(zhǔn)備：將過(guò)濾裝置（如一次性無(wú)菌過(guò)濾杯、真空過(guò)濾系統(tǒng)）、接收容器（如無(wú)菌離心管、三角燒瓶）在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)組裝，濾膜需提前檢查完整性（如通過(guò)氣泡點(diǎn)試驗(yàn)）。
預(yù)滅菌處理：對(duì)可重復(fù)使用的過(guò)濾裝置，需先經(jīng)高壓蒸汽滅菌；一次性裝置拆封后直接在無(wú)菌環(huán)境下使用。
過(guò)濾操作：將待除菌的培養(yǎng)基倒入過(guò)濾裝置，開啟真空泵或加壓裝置，控制流速均勻，避免濾膜堵塞；若培養(yǎng)基黏度較大，可適當(dāng)降低流速或分多次過(guò)濾。
收集儲(chǔ)存：過(guò)濾后的無(wú)菌培養(yǎng)基收集到無(wú)菌容器中，密封后置于 4℃冰箱短期保存，含抗生素的培養(yǎng)基建議現(xiàn)配現(xiàn)用。
關(guān)鍵注意事項(xiàng)
操作全程需在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，避免環(huán)境微生物污染。
濾膜使用后需及時(shí)處理，避免微生物擴(kuò)散；若過(guò)濾過(guò)程中濾膜破損，需重新過(guò)濾。
過(guò)濾前可先將培養(yǎng)基預(yù)過(guò)濾（用 0.45μm 濾膜），去除大顆粒雜質(zhì)，延長(zhǎng) 0.22μm 濾膜的使用壽命。
三、其他滅菌方法
（一）輻射滅菌法
滅菌原理：利用紫外線、γ 射線等輻射能量破壞微生物的核酸結(jié)構(gòu)，使其死亡。
適用范圍：主要用于培養(yǎng)基的表面滅菌或包裝后的滅菌，如已分裝密封的固體培養(yǎng)基平板，可通過(guò)紫外線照射表面滅菌；大規(guī)模生產(chǎn)中也可使用 γ 射線對(duì)包裝好的培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌。
關(guān)鍵注意事項(xiàng)：紫外線穿透力弱，僅能殺滅表面微生物，且對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分有一定破壞作用，需控制照射時(shí)間；γ 射線滅菌需專業(yè)設(shè)備，且需注意輻射防護(hù)。
（二）化學(xué)滅菌法
滅菌原理：利用化學(xué)消毒劑殺滅微生物，但由于化學(xué)物質(zhì)會(huì)殘留于培養(yǎng)基中，影響微生物或細(xì)胞生長(zhǎng)，因此極少直接用于培養(yǎng)基滅菌。
適用范圍：僅用于培養(yǎng)基制備環(huán)境的消毒（如無(wú)菌操作臺(tái)表面消毒），或?qū)嶒?yàn)器具的預(yù)處理，不用于培養(yǎng)基本身的滅菌。
四、滅菌方法的選擇與優(yōu)化
根據(jù)培養(yǎng)基成分選擇：
不含熱敏感成分：優(yōu)先選高壓蒸汽滅菌法（121℃、0.1MPa，20-30 分鐘）。
含葡萄糖等易分解成分：采用低壓蒸汽滅菌（115℃、0.06MPa，20 分鐘）。
含血清、抗生素等熱敏感成分：采用過(guò)濾除菌法。
根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇：
微生物培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)：對(duì)滅菌要求高，優(yōu)先選高壓蒸汽滅菌法。
細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)：需保留營(yíng)養(yǎng)成分活性，必須用過(guò)濾除菌法。
短期臨時(shí)使用的培養(yǎng)基：可選用流通蒸汽滅菌法。
優(yōu)化滅菌參數(shù)：
滅菌時(shí)間需根據(jù)培養(yǎng)基體積、成分調(diào)整，體積越大、有機(jī)物含量越高，滅菌時(shí)間可適當(dāng)延長(zhǎng)。
定期校準(zhǔn)滅菌設(shè)備（如高壓蒸汽滅菌鍋的壓力表、溫度傳感器），確保參數(shù)精準(zhǔn)。
五、滅菌效果驗(yàn)證
無(wú)論采用哪種滅菌方法，都需進(jìn)行滅菌效果驗(yàn)證，避免因操作失誤導(dǎo)致滅菌失敗：
無(wú)菌檢驗(yàn)：取少量滅菌后的培養(yǎng)基，置于適宜溫度（細(xì)菌 37℃、真菌 28℃）下培養(yǎng) 24-48 小時(shí)，若無(wú)菌落生長(zhǎng)，說(shuō)明滅菌合格；若有菌落生長(zhǎng)，需重新制備并排查原因。
指示劑驗(yàn)證：在滅菌鍋內(nèi)放置化學(xué)指示劑（如溫度敏感試紙）或生物指示劑（如含芽孢的枯草芽孢桿菌菌片），滅菌后觀察指示劑變化，若達(dá)到預(yù)設(shè)標(biāo)準(zhǔn)（如試紙變色、菌片無(wú)活菌生長(zhǎng)），說(shuō)明滅菌有效。
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