鼠檸檬酸桿菌的常見(jiàn)問(wèn)題與質(zhì)量控制及實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)范！
小楊 / 2025-12-01 09:56:07
鼠檸檬酸桿菌是腸桿菌科檸檬酸桿菌屬的革蘭氏陰性兼性厭氧桿菌，是小鼠腸道的天然致病菌，也是研究人類腸致病性大腸桿菌（EPEC）、腸出血性大腸桿菌（EHEC）等腸道致病菌致病機(jī)制的經(jīng)典模式菌株，其感染小鼠的病理特征與人類感染 EPEC/EHEC 高度相似。
一、生物學(xué)特性
1、形態(tài)與培養(yǎng)
形態(tài)：短桿狀，無(wú)芽孢，有鞭毛（能運(yùn)動(dòng)），革蘭氏染色陰性。
培養(yǎng)特性：
營(yíng)養(yǎng)要求不高，在普通 LB 培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基（MAC）、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基（EMB）上均可生長(zhǎng)；
最適生長(zhǎng)溫度 37℃，兼性厭氧，在有氧/無(wú)氧條件下均能繁殖；
在 MAC 培養(yǎng)基上因發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸，菌落呈粉紅色；在 EMB 培養(yǎng)基上呈紫黑色（中心有金屬光澤）。
2、生化特征
關(guān)鍵特性：發(fā)酵葡萄糖、乳糖、甘露醇產(chǎn)酸產(chǎn)氣，枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)陽(yáng)性（
檸檬酸桿菌屬核心特征），脲酶陰性，吲哚試驗(yàn)陰性，甲基紅試驗(yàn)陽(yáng)性，VP 試驗(yàn)陰性。
可還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，不產(chǎn)生 H?S。
3、遺傳特征
基因組大小約 5.1 Mb，攜帶與致病性相關(guān)的毒力島，編碼緊密黏附素、易位緊密黏附素受體（Tir）等關(guān)鍵毒力因子，與 EPEC/EHEC 的致病基因高度同源。
二、致病性與感染模型
1、宿主范圍
主要天然宿主為小鼠，對(duì)大鼠、倉(cāng)鼠等嚙齒類也有致病性，對(duì)人類無(wú)天然致病性（僅作為模式菌研究）。
2、致病機(jī)制
感染途徑：經(jīng)口攝入污染的食物/水，定植于小鼠結(jié)腸黏膜表面；
核心過(guò)程：通過(guò) LEE 毒力島編碼的 Ⅲ 型分泌系統(tǒng)（T3SS）向宿主腸上皮細(xì)胞注入效應(yīng)蛋白，介導(dǎo)細(xì)菌與上皮細(xì)胞的緊密黏附，形成“附著 - 擦拭”（A/E）損傷（腸上皮細(xì)胞微絨毛消失、細(xì)胞骨架重排形成基座結(jié)構(gòu)）；
病理表現(xiàn)：感染小鼠出現(xiàn)體重下降、腹瀉、結(jié)腸黏膜炎癥、上皮細(xì)胞凋亡、腸道屏障功能受損，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致結(jié)腸炎甚至死亡。
3、經(jīng)典應(yīng)用模型
腸道致病菌 A/E 損傷形成機(jī)制；
宿主腸道黏膜免疫應(yīng)答（如 T 細(xì)胞、固有免疫細(xì)胞的作用）；
益生菌/抗菌藥物對(duì)腸道致病菌的抑制效果；
炎癥性腸病（IBD）發(fā)病機(jī)制的核心模型。
三、實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)范
1、分離與鑒定流程
樣本采集：感染小鼠的糞便、結(jié)腸內(nèi)容物或黏膜組織；
分離培養(yǎng)：將樣本梯度稀釋后涂布于 MAC/EMB 培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng) 18-24 h，挑取特征菌落純化；
鑒定方法：
①生化鑒定：通過(guò) API 20E 生化鑒定條或全自動(dòng)微生物鑒定儀確認(rèn)生化特征；
②分子鑒定：PCR 擴(kuò)增特異性基因，測(cè)序驗(yàn)證。
2、培養(yǎng)與保藏
常規(guī)培養(yǎng)：LB 液體培養(yǎng)基 37℃、200 rpm 振蕩培養(yǎng) 12-16 h，或 LB 固體培養(yǎng)基劃線培養(yǎng) 18-24 h；
保藏方法：
短期保藏：4℃斜面保存（1-2 周）；
長(zhǎng)期保藏：20% 甘油菌液 - 80℃凍存，或凍干保藏（可保存數(shù)年）。
3、生物安全與操作注意事項(xiàng)
生物安全等級(jí)：BSL-2（實(shí)驗(yàn)室操作需在二級(jí)生物安全柜中進(jìn)行）；
操作要求：佩戴無(wú)菌手套、口罩，實(shí)驗(yàn)后對(duì)耗材/工作臺(tái)進(jìn)行消毒；
廢棄物處理：感染性培養(yǎng)基、動(dòng)物樣本需高壓滅菌（121℃、20 min）后丟棄。
四、常見(jiàn)問(wèn)題與質(zhì)量控制
1、菌株退化
表現(xiàn)：多次傳代后毒力下降（感染小鼠后無(wú)病理癥狀）、生化特征改變；
原因：毒力基因丟失、培養(yǎng)條件不當(dāng)；
控制：減少傳代次數(shù)（≤5 代），使用凍存的原始菌株復(fù)蘇，復(fù)蘇后驗(yàn)證毒力（感染小鼠觀察體重/結(jié)腸病理）。
2、污染排查
若培養(yǎng)物出現(xiàn)非特征菌落，需排查是否混雜
沙門氏菌、
志賀菌等非乳糖發(fā)酵菌；
驗(yàn)證方法：革蘭氏染色鏡檢（確認(rèn)形態(tài)）+ 生化補(bǔ)測(cè)。
3、感染模型失敗
常見(jiàn)原因：小鼠品系選擇不當(dāng)、菌株毒力不足、感染劑量過(guò)低（常規(guī)感染劑量 10? CFU /只）；
優(yōu)化：使用 SPF 級(jí)小鼠，感染前禁食 12 h，采用灌胃方式感染，感染后監(jiān)測(cè)小鼠體重和糞便載菌量。
五、應(yīng)用拓展
腸道微生態(tài)互作研究（如與腸道共生菌的競(jìng)爭(zhēng)定植）；
抗菌肽/新型抗生素的體內(nèi)篩選；
宿主 - 病原體互作的分子機(jī)制研究（如宿主細(xì)胞信號(hào)通路調(diào)控）。
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