產氣莢膜梭狀芽孢桿菌菌落計數法的標準操作規(guī)程及注意事項！
小楊 / 2025-11-26 09:24:36
產氣莢膜梭狀芽孢桿菌（Clostridium perfringens，簡稱產氣莢膜梭菌）是革蘭氏陽性、厭氧、產芽孢的致病菌，廣泛存在于土壤、污水、食品及人和動物腸道中，可引發(fā)氣性壞疽、食物中毒等疾病。其菌落計數需結合厭氧菌培養(yǎng)特性和選擇性培養(yǎng)基，核心方法為平板傾注法，輔以菌落形態(tài)鑒定和生化確認，確保計數準確性。以下是詳細的標準操作規(guī)程（SOP）、原理、注意事項及質量控制要點：
一、核心原理
產氣莢膜梭菌為嚴格厭氧菌，在有氧環(huán)境下無法生長；能產生耐熱芽孢，可耐受一定溫度（如 80℃ 10 分鐘）；發(fā)酵葡萄糖、乳糖等產酸產氣，在含指示劑的培養(yǎng)基上形成特征菌落（如黑色菌落、周圍有溶血環(huán)）。
菌落計數的核心邏輯：
樣品前處理：通過加熱（80℃ 10 分鐘）殺滅非芽孢菌和脆弱芽孢，保留產氣莢膜梭菌的耐熱芽孢，減少雜菌干擾；
梯度稀釋：將樣品稀釋至合適濃度，確保平板上形成 30~300 個可計數的菌落；
厭氧培養(yǎng)：采用厭氧罐、厭氧袋或厭氧工作站，提供嚴格無氧環(huán)境（O?濃度＜1%）；
選擇性分離：使用含抗生素和指示劑的培養(yǎng)基，抑制革蘭氏陰性菌和其他厭氧菌，目標菌因產生硫化氫（H?S）與鐵離子結合形成黑色菌落，便于識別；
菌落計數與確認：統(tǒng)計特征菌落數，結合生化試驗排除假陽性，最終計算樣品中產氣莢膜梭菌的菌落形成單位（CFU/g 或 CFU/mL）。
二、標準操作規(guī)程（SOP）
（一）實驗材料準備
培養(yǎng)基：
首選：亞硫酸鹽 - 多粘菌素 - 磺胺嘧啶瓊脂（SPS 瓊脂） —— 選擇性強，含亞硫酸鹽、檸檬酸鐵銨（指示劑）和多粘菌素/磺胺嘧啶（抑制革蘭氏陰性菌），產氣莢膜梭菌形成黑色菌落，周圍有暈環(huán)；
替代：強化梭菌瓊脂（RCA）+ 卡那霉素（200 μg/mL） —— 適用于食品、環(huán)境樣品，抑制雜菌效果好；
增菌培養(yǎng)基（可選）：皰肉培養(yǎng)基（Cooked Meat Medium, CMM） —— 用于樣品中目標菌濃度極低時的預增菌。
試劑與耗材：
稀釋液：0.1% 蛋白胨水（或生理鹽水），需煮沸除氧后冷卻（避免厭氧環(huán)境被破壞）；
厭氧設備：厭氧罐、厭氧產氣袋（含催化劑，如鈀）、厭氧指示劑（亞甲基藍，無氧時無色，有氧時藍色）；
其他：無菌離心管、移液槍、培養(yǎng)皿（90 mm）、恒溫水浴鍋（80℃）、恒溫培養(yǎng)箱（37℃）。
樣品：食品、土壤、污水、糞便等，需無菌采樣并盡快檢測（≤24 小時，4℃冷藏運輸）。
（二）操作步驟
1、樣品前處理（關鍵步驟：芽孢活化與雜菌抑制）
稱取 10 g（或吸取 10 mL）樣品，加入 90 mL 預冷的無菌稀釋液（0.1% 蛋白胨水），渦旋振蕩 2 分鐘，制成 1:10 勻漿液；
將勻漿液放入 80℃ 恒溫水浴鍋，保溫 10 分鐘（精確計時），迅速取出并冰水浴冷卻至室溫（目的：殺滅非芽孢菌和不耐熱芽孢，僅保留產氣莢膜梭菌的耐熱芽孢）；
若樣品中目標菌濃度極低（如潔凈環(huán)境樣品），可先將勻漿液接種至皰肉培養(yǎng)基，37℃ 厭氧培養(yǎng) 18~24 小時（預增菌），再進行后續(xù)稀釋。
2、梯度稀釋
取冷卻后的 1:10 勻漿液 1 mL，加入 9 mL 無菌稀釋液（除氧后），渦旋混勻，制成 1:100 稀釋液；
按上述方法依次梯度稀釋至 10??~10??（根據樣品污染程度調整，食品樣品通常稀釋至 10??~10??，土壤樣品需稀釋至 10??~10??）；
稀釋過程中，每步移液槍頭需無菌更換，稀釋液試管需加蓋密封，避免氧氣進入。
3、平板傾注與厭氧培養(yǎng)
取 3 個連續(xù)稀釋度的稀釋液，每個稀釋度吸取 1 mL 加入無菌培養(yǎng)皿（平行做 3 個重復）；
傾注融化并冷卻至 45~50℃的 SPS 瓊脂（避免溫度過高殺死芽孢，過低導致培養(yǎng)基凝固），迅速輕輕旋轉培養(yǎng)皿，使稀釋液與培養(yǎng)基充分混勻，靜置凝固（約 15 分鐘）；
將凝固后的平板倒置放入厭氧罐，放入厭氧產氣袋和亞甲基藍指示劑，密封厭氧罐（確保無漏氣），置于 37℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24~48 小時（培養(yǎng)時間不足會導致菌落過小，超過 48 小時可能出現(xiàn)雜菌污染）。
4、菌落計數與形態(tài)鑒定
取出厭氧罐，觀察指示劑（亞甲基藍無色，說明厭氧環(huán)境合格）；
統(tǒng)計每個平板上的特征菌落：SPS 瓊脂上為黑色、圓形、光滑、直徑 2~4 mm，周圍有淡棕色暈環(huán)（H?S 與鐵離子反應產物），菌落中心黑色更深；
排除異常菌落：白色、透明、無暈環(huán)的菌落為雜菌，不予計數；
選擇菌落數在 30~300 之間的平板進行計數，若所有平板菌落數均超過 300，取最高稀釋度的平板計數；若均低于 30，取最低稀釋度的平板計數（結果表示為“＜XX CFU / 樣品”）。
5、生化確認（排除假陽性，可選但推薦）
挑取 3~5 個特征菌落，接種至皰肉培養(yǎng)基（37℃ 厭氧培養(yǎng) 18 小時），進行以下鑒定：
Nagler 反應：接種菌落至含 20% 卵黃的瓊脂平板，一側涂抹 α- 毒素抗血清，37℃ 厭氧培養(yǎng) 24 小時；若未涂抹抗血清的一側出現(xiàn)乳白色沉淀環(huán)（α- 毒素分解卵黃卵磷脂），涂抹側無沉淀環(huán)，為陽性（產氣莢膜梭菌特有）；
產酸產氣試驗：接種至葡萄糖、乳糖、蔗糖發(fā)酵管，37℃ 厭氧培養(yǎng) 24 小時，產氣莢膜梭菌發(fā)酵所有糖類，產酸產氣（培養(yǎng)基變黃，倒置小管內有氣體）；
革蘭氏染色：革蘭氏陽性粗短桿菌，無鞭毛，形成橢圓形芽孢（位于菌體中央或近端，不膨出菌體）。
6、結果計算
公式：樣品中產氣莢膜梭菌濃度（CFU/g 或 CFU/mL）= 平均菌落數 × 稀釋倍數 ÷ 接種體積（1 mL）；
示例：10?? 稀釋度的 3 個平板菌落數分別為 45、52、48，平均菌落數 =（45+52+48）/3=48.3，稀釋倍數 = 10?，接種體積 = 1 mL，則樣品濃度 = 48.3 × 10? = 4.83 × 10? CFU/g（結果保留 2 位有效數字，可表示為 4.8×10? CFU/g）。
三、關鍵注意事項
1、厭氧環(huán)境控制：
培養(yǎng)基需煮沸除氧（100℃ 15 分鐘），冷卻后盡快使用，避免氧氣重新溶解；
厭氧罐密封前需排出內部空氣（可通過反復抽真空 - 充氮氣 3 次實現(xiàn)），產氣袋需在有效期內使用，催化劑（鈀）需保持活性（若亞甲基藍指示劑始終藍色，說明厭氧失敗，需更換產氣袋或催化劑）；
平板培養(yǎng)時需倒置，避免冷凝水滴落導致菌落融合。
2、樣品前處理精度：
加熱溫度和時間必須嚴格控制（80℃ 10 分鐘），溫度過高會殺死產氣莢膜梭菌芽孢，過低則無法抑制雜菌；
勻漿液需充分振蕩（≥2 分鐘），確保樣品均勻分散，避免菌落聚集導致計數偏低。
3、培養(yǎng)基選擇與質量：
需使用新鮮制備的 SPS 瓊脂（存放不超過 7 天），抗生素需在培養(yǎng)基冷卻至 45~50℃時加入（避免高溫破壞藥效）；
若培養(yǎng)基顏色異?；蛴须s菌污染，需重新制備。
4、稀釋與接種操作：
稀釋液需無菌、除氧，每步稀釋后需渦旋混勻（≥1 分鐘），避免稀釋不均；
接種時移液槍頭需深入稀釋液液面下吸取，減少氧氣帶入。
5、菌落識別準確性：
部分梭菌（如
破傷風梭菌、
肉毒梭菌）也可能在 SPS 瓊脂上形成黑色菌落，需通過 Nagler 反應、產糖試驗等生化方法確認，避免假陽性計數；
若菌落過于密集或融合，需重新稀釋接種。
四、質量控制（QC）要點
1、陽性對照：
每次實驗需設置陽性對照：接種產氣莢膜梭菌標準菌株（如
ATCC 13124），按相同步驟處理，應在 SPS 瓊脂上形成典型黑色菌落，Nagler 反應陽性；
標準菌株需定期傳代（每 3~6 個月），4℃ 皰肉培養(yǎng)基中保存，避免失活。
2、陰性對照：
空白對照：取 1 mL 無菌稀釋液接種平板，培養(yǎng)后應無菌落生長（排除培養(yǎng)基、耗材污染）；
3、計數精密度：
同一稀釋度的 3 個平行平板菌落數變異系數（CV）應≤15%，否則需重新實驗；
若不同稀釋度平板的菌落數均在 30~300 之間，需計算各稀釋度的平均值，確保結果一致性。
4、培養(yǎng)基質量控制：
每批次培養(yǎng)基需檢測無菌性（37℃ 厭氧培養(yǎng) 24 小時，無雜菌生長）；
檢測指示劑有效性：接種陽性菌株后，應形成明顯黑色菌落（確保亞硫酸鹽、檸檬酸鐵銨有效）。
五、常見問題與解決方案
常見問題 可能原因 解決方案
平板無菌落生長 1.厭氧環(huán)境失?。ㄖ甘緞┧{色）；2.加熱處理過度（殺死芽孢）；3.樣品中無目標菌；4.培養(yǎng)基抗生素濃度過高 1.更換產氣袋和催化劑，重新密封厭氧罐；2.嚴格控制 80℃ 10 分鐘，避免超時；3.增加預增菌步驟；4.調整抗生素濃度
雜菌過多（白色菌落占比高） 1.樣品前處理不充分（雜菌芽孢未被抑制）；2.培養(yǎng)基選擇性不足；3.稀釋倍數過低 1.延長加熱時間或增加稀釋倍數；2.更換新鮮 SPS 瓊脂，確保抗生素有效；3.提高稀釋倍數
菌落顏色不典型（淡黑色） 1.培養(yǎng)時間不足（＜24 小時）；2.培養(yǎng)基指示劑含量不足；3.目標菌代謝活性低 1.延長培養(yǎng)至 48 小時；2.檢查培養(yǎng)基配方，確保亞硫酸鹽和檸檬酸鐵銨添加量準確；3.優(yōu)化培養(yǎng)溫度（37±1℃），避免溫度波動
計數結果偏高 1.菌落融合（稀釋倍數不足）；2.假陽性菌落未排除 1.提高稀釋倍數，確保菌落分散；2.對特征菌落進行生化確認，排除雜菌
計數結果偏低 1.稀釋時樣品未混勻；2.冷凝水滴落導致菌落融合；3.接種量不足 1.稀釋后渦旋混勻≥1 分鐘；2.平板倒置培養(yǎng)，避免冷凝水；3.確保接種量準確（1 mL），移液槍校準
六、應用場景
食品衛(wèi)生檢測：肉類、罐頭、乳制品等食品中產氣莢膜梭菌計數，判斷是否符合食品安全標準；
環(huán)境監(jiān)測：土壤、污水、醫(yī)療環(huán)境的污染程度評估，預防交叉感染；
臨床診斷：糞便、傷口分泌物中目標菌計數，輔助診斷氣性壞疽、食物中毒；
科研應用：耐藥菌株篩選、消毒效果評價、益生菌對產氣莢膜梭菌的抑制作用研究。
七、總結
產氣莢膜梭菌的菌落計數核心是“芽孢活化 - 厭氧選擇性培養(yǎng) - 特征菌落鑒定”，關鍵在于嚴格控制厭氧環(huán)境、樣品前處理精度和培養(yǎng)基質量，通過陽性/陰性對照和生化確認確保結果準確。實驗中需重點關注厭氧有效性和雜菌抑制，避免因操作不當導致計數偏差。該方法適用于多類樣品，是微生物檢測中常用的標準化技術，為食品安全、臨床診斷和科研提供可靠數據支持。
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