大鼠脈絡(luò)膜成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)鑒定方法及操作要點(diǎn)！
小楊 / 2025-11-17 09:42:44
一、形態(tài)學(xué)鑒定（基礎(chǔ)初篩）
形態(tài)學(xué)是最直觀的初步鑒定手段，通過光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)方式，排除明顯雜細(xì)胞污染，初步判斷細(xì)胞是否符合成纖維細(xì)胞的典型特征。
1、光學(xué)顯微鏡觀察（倒置相差顯微鏡）
典型形態(tài)特征：
貼壁生長(zhǎng)，呈長(zhǎng)梭形或多角形，胞體舒展，有明顯的胞質(zhì)突起（1-2 個(gè)主突起，分支少）；
細(xì)胞核呈橢圓形或扁圓形，位于細(xì)胞中央或偏位，核仁清晰（1-2 個(gè)）；
細(xì)胞排列具有“方向性”，常呈漩渦狀、束狀或平行排列（原代培養(yǎng)早期可能因細(xì)胞來源區(qū)域差異略有分散，傳代 1-2 次后形態(tài)更統(tǒng)一）。
雜細(xì)胞排除：
若出現(xiàn)圓形、緊密貼壁且呈“鋪路石樣”排列的細(xì)胞，可能是脈絡(luò)膜內(nèi)皮細(xì)胞；
若出現(xiàn)多角形、胞質(zhì)富含色素顆粒的細(xì)胞，可能是視網(wǎng)膜色素上皮（RPE）細(xì)胞；
2、蘇木精 - 伊紅（HE）染色
用途：進(jìn)一步清晰觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)，區(qū)分細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)，輔助判斷細(xì)胞純度。
染色結(jié)果：
成纖維細(xì)胞細(xì)胞核呈藍(lán)紫色（蘇木精著色），細(xì)胞質(zhì)呈淡粉紅色（伊紅著色），胞質(zhì)內(nèi)無色素顆粒，細(xì)胞輪廓及梭形結(jié)構(gòu)更清晰；
雜細(xì)胞胞質(zhì)會(huì)因色素顆粒呈現(xiàn)棕褐色，可直接區(qū)分。
二、特異性標(biāo)志物鑒定（核心驗(yàn)證：排除雜細(xì)胞，確認(rèn)細(xì)胞身份）
成纖維細(xì)胞有其獨(dú)特的細(xì)胞表面標(biāo)志物或胞質(zhì)蛋白，通過免疫熒光染色（IF） 或免疫印跡檢測(cè)特異性標(biāo)志物，并結(jié)合“陰性標(biāo)志物”排除雜細(xì)胞，是最常用且可靠的鑒定方法。
1、核心陽(yáng)性標(biāo)志物（成纖維細(xì)胞特異性）
標(biāo)志物名稱 蛋白功能 檢測(cè)方法 陽(yáng)性結(jié)果特征
波形蛋白（Vimentin） 間質(zhì)細(xì)胞特異性中間絲蛋白，成纖維細(xì)胞骨架核心成分 IF/WB IF：胞質(zhì)呈彌漫性綠色（或?qū)?yīng)熒光色），沿細(xì)胞突起分布；WB：在～57 kDa 處出現(xiàn)特異性條帶
成纖維細(xì)胞特異性蛋白 1（FSP1/S100A4） 成纖維細(xì)胞分化相關(guān)蛋白，調(diào)控細(xì)胞遷移 IF/WB IF：胞質(zhì)呈陽(yáng)性信號(hào)，無核染色；WB：在～12 kDa 處出現(xiàn)條帶
α- 平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA） 部分活化成纖維細(xì)胞表達(dá)，靜止態(tài)成纖維細(xì)胞低表達(dá) IF/WB IF：胞質(zhì)呈絲狀陽(yáng)性信號(hào)；需注意：僅活化態(tài)陽(yáng)性，靜止態(tài)需結(jié)合其他標(biāo)志物
2、陰性標(biāo)志物（排除雜細(xì)胞污染）
為確保細(xì)胞純度，需同時(shí)檢測(cè)雜細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，確認(rèn)其陰性表達(dá)：
脈絡(luò)膜內(nèi)皮細(xì)胞：CD31（血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子）、von Willebrand 因子（vWF）；
視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞：細(xì)胞角蛋白 18/19（CK18/CK19，上皮細(xì)胞特異性中間絲蛋白）、RPE65（RPE 細(xì)胞特異性視黃醇異構(gòu)酶）；
免疫細(xì)胞：CD45（白細(xì)胞共同抗原，淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞均表達(dá)）。
3、操作注意事項(xiàng)
IF 檢測(cè)：需設(shè)置“陽(yáng)性對(duì)照”和“陰性對(duì)照”，避免非特異性染色干擾結(jié)果；
WB 檢測(cè)：需用內(nèi)參蛋白校正上樣量，確保結(jié)果定量準(zhǔn)確性。
三、功能特性鑒定（確認(rèn)細(xì)胞活性與功能完整性）
除“身份確認(rèn)”外，還需驗(yàn)證原代細(xì)胞是否保留成纖維細(xì)胞的核心功能，確保其可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)（如細(xì)胞信號(hào)通路研究、疾病模型構(gòu)建）。
1、增殖能力鑒定（MTT 法/CCK-8 法）
原理：利用活細(xì)胞線粒體脫氫酶將 MTT（或 CCK-8 試劑）還原為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物量與活細(xì)胞數(shù)正相關(guān)；
操作：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于 96 孔板，連續(xù) 3-5 天檢測(cè)吸光度（MTT 檢測(cè)波長(zhǎng) 570 nm，CCK-8 檢測(cè)波長(zhǎng) 450 nm），繪制生長(zhǎng)曲線；
結(jié)果判斷：成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)曲線呈“S”型，增殖活躍（原代細(xì)胞前 3 代增殖能力較強(qiáng)，傳代次數(shù)過多后增殖會(huì)減緩），若生長(zhǎng)緩慢或停滯，可能提示細(xì)胞活力不足。
2、膠原分泌能力鑒定（成纖維細(xì)胞核心功能）
成纖維細(xì)胞的主要功能是合成并分泌膠原（如 Ⅰ 型膠原、Ⅲ 型膠原），可通過以下方法檢測(cè)：
免疫熒光染色：檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)/細(xì)胞外膠原表達(dá)，Ⅰ 型膠原（Collagen Ⅰ）陽(yáng)性信號(hào)主要分布于胞質(zhì)及細(xì)胞外基質(zhì)；
酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）：收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，檢測(cè)分泌到培養(yǎng)基中的膠原含量，直接反映細(xì)胞分泌功能；
天狼星紅染色：對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原進(jìn)行特異性染色（呈紅色），可通過圖像分析定量膠原沉積量。
3、遷移能力鑒定（劃痕愈合實(shí)驗(yàn)/Transwell 實(shí)驗(yàn)）
劃痕愈合實(shí)驗(yàn)：
細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿后，用無菌槍頭在細(xì)胞層劃一條均勻劃痕，PBS 洗去脫落細(xì)胞；
培養(yǎng) 0 h、24 h、48 h 后觀察劃痕寬度變化，計(jì)算“愈合率”（愈合率 =(初始劃痕寬度 - 各時(shí)間點(diǎn)劃痕寬度)/初始劃痕寬度 ×100%）；
結(jié)果：成纖維細(xì)胞具有較強(qiáng)遷移能力，24 h 愈合率通?？蛇_(dá) 30%-50%（具體因細(xì)胞活性而異）。
Transwell 實(shí)驗(yàn)：
上室接種細(xì)胞（無血清培養(yǎng)基），下室加入含血清的培養(yǎng)基（趨化因子）；
培養(yǎng) 24 h 后，固定下室膜表面的遷移細(xì)胞并染色，計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)；
結(jié)果：成纖維細(xì)胞可主動(dòng)遷移至下室，遷移細(xì)胞數(shù)顯著高于陰性對(duì)照（如固定的死細(xì)胞）。
四、其他輔助鑒定（可選，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求）
1、染色體核型分析
用途：確認(rèn)細(xì)胞為大鼠來源（排除人源或其他動(dòng)物細(xì)胞污染），且核型無明顯變異（原代細(xì)胞早期核型應(yīng)與大鼠正常核型一致，即 42 條染色體，XY/XX）；
適用場(chǎng)景：需長(zhǎng)期培養(yǎng)或用于遺傳學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn)時(shí)。
2、病原體檢測(cè)（確保細(xì)胞無污染）
檢測(cè)項(xiàng)目：細(xì)菌（如葡萄球菌、大腸桿菌）、真菌（如酵母菌、霉菌）、支原體（細(xì)胞培養(yǎng)常見污染）；
檢測(cè)方法：
細(xì)菌/真菌：培養(yǎng)法（細(xì)胞上清液接種 LB 培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng) 24-48 h 觀察菌落）或熒光染色法（DAPI 染色，觀察是否有非細(xì)胞來源的核酸信號(hào)）；
支原體：PCR 法（檢測(cè)支原體特異性基因）或支原體檢測(cè)試劑盒，確保細(xì)胞無支原體污染（支原體會(huì)嚴(yán)重影響細(xì)胞功能，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏差）。
初步篩選：光學(xué)顯微鏡觀察形態(tài)（長(zhǎng)梭形、漩渦狀排列），HE 染色排除色素細(xì)胞；
核心驗(yàn)證：免疫熒光/WB 檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)志物（Vimentin、FSP1）+ 陰性標(biāo)志物（CD31、CK18、CD45），確認(rèn)細(xì)胞身份及純度；
功能確認(rèn)：MTT/CCK-8 檢測(cè)增殖、ELISA /天狼星紅檢測(cè)膠原分泌、劃痕/ Transwell 檢測(cè)遷移，確保細(xì)胞功能完整；
質(zhì)量控制：可選染色體核型分析和病原體檢測(cè)，滿足特定實(shí)驗(yàn)需求。
通過以上多維度鑒定，可確保培養(yǎng)的細(xì)胞為高純度、高活性的原代大鼠脈絡(luò)膜成纖維細(xì)胞，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供可靠的細(xì)胞模型。
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