黑曲霉涂布操作前準(zhǔn)備工作與核心步驟及注意事項(xiàng)有哪些？
小楊 / 2025-09-29 09:12:41
黑曲霉涂布操作的核心是無(wú)菌操作與均勻涂布，需通過(guò)制備菌懸液、倒平板、梯度稀釋（可選）、涂布等步驟，最終獲得單菌落或均勻的菌苔，具體步驟如下：
一、操作前準(zhǔn)備（關(guān)鍵：無(wú)菌環(huán)境與物料）
1、環(huán)境與器具滅菌
超凈工作臺(tái)提前 30 分鐘開(kāi)啟紫外燈滅菌，隨后切換為送風(fēng)模式。
涂布棒、EP 管、移液槍槍頭、生理鹽水（或無(wú)菌水）需經(jīng)高壓蒸汽滅菌（121℃，20 分鐘）；培養(yǎng)皿需干熱滅菌（160-180℃，2-3 小時(shí)）。
2、菌種與試劑準(zhǔn)備
取活化好的黑曲霉菌種（斜面培養(yǎng)基培養(yǎng) 3-5 天，長(zhǎng)滿孢子），提前在超凈臺(tái)旁準(zhǔn)備好。
若需梯度稀釋，準(zhǔn)備無(wú)菌生理鹽水（0.85% NaCl），按 10?¹、10?²、10?³ 等梯度分裝 EP 管（每管 9mL）。
二、核心操作步驟（分“倒平板→制菌懸液→涂布”三步）
1、倒平板（奠定無(wú)菌培養(yǎng)基礎(chǔ)）
戴無(wú)菌手套，在超凈臺(tái)內(nèi)取出滅菌后的培養(yǎng)皿，打開(kāi)皿蓋（僅打開(kāi) 1/3，避免污染）。
用無(wú)菌移液管吸取 15-20mL 保溫的 PDA 培養(yǎng)基，倒入培養(yǎng)皿中，輕輕晃動(dòng)使培養(yǎng)基均勻覆蓋皿底。
蓋上皿蓋，置于水平桌面，待培養(yǎng)基自然凝固（約 20-30 分鐘，避免移動(dòng)），標(biāo)記培養(yǎng)基名稱與日期。
2、制備黑曲霉菌懸液（關(guān)鍵：分散孢子/菌絲）
用無(wú)菌移液管吸取 5-10mL 無(wú)菌生理鹽水，注入黑曲霉斜面菌種管中。
用無(wú)菌接種環(huán)輕輕刮取斜面表面的黑曲霉孢子（避免刮傷培養(yǎng)基），反復(fù)吹吸生理鹽水，使孢子充分分散到液體中，制成初始菌懸液。
若菌懸液有菌絲團(tuán)，可用無(wú)菌紗布過(guò)濾（或用移液槍反復(fù)吹吸），確保孢子單一分散。
3、梯度稀釋（可選：需單菌落時(shí)操作）
用無(wú)菌移液槍吸取 1mL 初始菌懸液，注入裝有 9mL 無(wú)菌生理鹽水的 EP 管中（10?¹ 稀釋度），蓋緊蓋子后反復(fù)顛倒混勻（至少 10 次）。
按上述方法，從 10?¹ 稀釋管中吸取 1mL 菌懸液，注入新的 9mL 無(wú)菌生理鹽水管中（10?² 稀釋度），依次制備所需稀釋度（黑曲霉常用 10?³-10??稀釋度）。
4、涂布操作（核心：均勻分布）
用無(wú)菌移液槍吸取 0.1-0.2mL 目標(biāo)稀釋度的菌懸液，滴加在已凝固的 PDA 平板中央（每平板 1 份菌懸液）。
取滅菌后的涂布棒（可在酒精燈外焰快速過(guò)一下，冷卻 10 秒后使用，避免燙傷菌種），將菌懸液從平板中央向四周輕輕推動(dòng)，確保菌液均勻覆蓋整個(gè)培養(yǎng)基表面（同一方向推 2-3 次，再旋轉(zhuǎn)平板推 2-3 次）。
涂布完成后，打開(kāi)皿蓋，在超凈臺(tái)內(nèi)靜置 5-10 分鐘，讓菌懸液中的水分充分吸收（避免培養(yǎng)時(shí)菌液流動(dòng)）。
5、培養(yǎng)與觀察
將平板倒置（皿蓋在下，皿底在上，防止冷凝水滴落污染菌落），放入 28-30℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng) 3-5 天。
培養(yǎng)期間定期觀察，待平板上出現(xiàn)黑曲霉的典型菌落（黑色孢子層，周圍有白色菌絲），即可停止培養(yǎng)，進(jìn)行后續(xù)計(jì)數(shù)或純化。
三、關(guān)鍵注意事項(xiàng)（避免操作失?。?/strong>
嚴(yán)格無(wú)菌：所有操作需在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，手部、器具避免接觸非無(wú)菌區(qū)域；涂布棒冷卻不徹底會(huì)殺死菌種，冷卻過(guò)度可能導(dǎo)致污染，可通過(guò)觸碰培養(yǎng)基邊緣測(cè)試溫度（無(wú)燙痕即可）。
菌懸液分散：黑曲霉易形成菌絲團(tuán)，制備菌懸液時(shí)需充分吹吸或過(guò)濾，否則涂布后菌落聚集，無(wú)法獲得單菌落。
涂布力度：推動(dòng)涂布棒時(shí)力度要輕，避免劃破培養(yǎng)基表面，導(dǎo)致菌液殘留，影響菌落形態(tài)。
稀釋度選擇：若目標(biāo)是單菌落，需通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定合適稀釋度，確保每平板菌落數(shù)在 30-300 之間（便于計(jì)數(shù)）；若僅需菌苔，可直接用未稀釋的菌懸液涂布。
四、總結(jié)
黑曲霉涂布的核心是“無(wú)菌 + 均勻”：前期做好滅菌與物料準(zhǔn)備，中期通過(guò)輕柔操作實(shí)現(xiàn)菌懸液均勻分布，后期控制培養(yǎng)條件，即可高效獲得目標(biāo)菌落。操作時(shí)需重點(diǎn)關(guān)注菌懸液分散度與涂布棒溫度，避免因污染或操作不當(dāng)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。
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