UBA培養(yǎng)基的原理和使用方法及具體操作流程與注意事項！
小楊 / 2025-07-16 09:15:51
UBA 培養(yǎng)基，全稱 Universal Beer Agar，雖然名字中有“啤酒”，但現(xiàn)代配方已標(biāo)準(zhǔn)化，不再使用啤酒。它是一種營養(yǎng)豐富、專為培養(yǎng)厭氧菌設(shè)計的非選擇性培養(yǎng)基。
1、豐富的營養(yǎng)基礎(chǔ)：
蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏：提供細(xì)菌生長所需的氮源、碳源、維生素、礦物質(zhì)和氨基酸等復(fù)雜營養(yǎng)物質(zhì)，滿足厭氧菌苛刻的營養(yǎng)需求。
葡萄糖：提供易被快速利用的碳源和能源。
可溶性淀粉：作為碳源補(bǔ)充，同時被認(rèn)為可能有助于吸收培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物（如脂肪酸），從而促進(jìn)某些厭氧菌的生長。
2、創(chuàng)造厭氧環(huán)境的關(guān)鍵成分：
半胱氨酸鹽酸鹽或硫乙醇酸鹽：這是UBA作為厭氧培養(yǎng)基的核心原理所在。這些化合物是強(qiáng)還原劑。
它們能有效消耗培養(yǎng)基中的溶解氧。
它們能降低培養(yǎng)基的氧化還原電勢（Eh），使其達(dá)到厭氧菌生長所需的低Eh水平（通常<-150mV）。嚴(yán)格厭氧菌缺乏足夠的酶系統(tǒng)（如過氧化氫酶、超氧化物歧化酶）來中和有氧代謝產(chǎn)生的有毒氧自由基（如過氧化氫、超氧陰離子），因此必須在低Eh環(huán)境下才能生存和繁殖。
刃天青（常作為指示劑添加）：這是一種氧化還原指示劑。
氧化狀態(tài)呈粉紅色或紫色。
還原狀態(tài)呈無色。
當(dāng)培養(yǎng)基被正確還原且保持厭氧時，刃天青應(yīng)變?yōu)闊o色，直觀地指示內(nèi)部環(huán)境適合厭氧菌生長。如果看到粉紅色，則表明有氧存在，環(huán)境不適合嚴(yán)格厭氧菌。
3、其他成分：
氯化鈉：維持等滲環(huán)境。
瓊脂（Agar）：提供固體支持（用于UBA瓊脂平板）。液體形式則不添加瓊脂。
磷酸氫二鉀：緩沖劑，幫助穩(wěn)定培養(yǎng)基pH。
(一) 培養(yǎng)基制備
稱量溶解：按產(chǎn)品說明書準(zhǔn)確稱取規(guī)定量的UBA干粉培養(yǎng)基。將其懸浮于適量（通常是1升）的蒸餾水或去離子水中。
加熱煮沸：邊攪拌邊加熱至完全溶解（避免燒焦）。
調(diào)節(jié)pH：冷卻至室溫后，用1N NaOH或1N HCl將pH調(diào)節(jié)至6.8 ± 0.2（具體pH值參照說明書，不同品牌可能略有差異）。注意：pH調(diào)節(jié)應(yīng)在滅菌前進(jìn)行。
分裝：
液體培養(yǎng)基（UBB）：將溶液分裝至試管或燒瓶中。裝液量不宜超過容器體積的一半（如試管裝10-15ml），以保證深部有足夠的厭氧層。通常添加少量（約0.1%）瓊脂（如0.1g/L）或使用大理石碎片/浮珠，有助于限制氧氣擴(kuò)散。
固體培養(yǎng)基（UBA瓊脂平板）：加入所需量的瓊脂（通常約1.5%），重新加熱煮沸使瓊脂完全溶解。稍冷卻（約50°C）后，無菌操作倒入無菌培養(yǎng)皿（約15-20ml/90mm皿）。
滅菌：采用高壓蒸汽滅菌。標(biāo)準(zhǔn)條件是 121°C (15 psi) 滅菌15分鐘。
重要提示：滅菌后，必須讓培養(yǎng)基緩慢冷卻至50°C左右再分裝（液體）或倒平板（固體）?？焖倮鋮s可能導(dǎo)致玻璃器皿破裂或瓊脂凝固不均勻。
還原（若需要）：對于極其敏感的嚴(yán)格厭氧菌，滅菌冷卻后，可在無菌條件下向液體培養(yǎng)基或剛?cè)诨沫傊ɡ鋮s至50°C）中加入少量新鮮配制的無菌還原劑溶液，并重新短暫加熱驅(qū)除溶解氧，然后迅速冷卻并置于厭氧環(huán)境中。刃天青指示劑應(yīng)變?yōu)闊o色。
(二) 接種與培養(yǎng)
樣品處理：根據(jù)樣品來源（臨床樣本如膿液、組織、糞便；環(huán)境樣本如土壤、淤泥；食品樣本等）進(jìn)行適當(dāng)?shù)那疤幚恚ㄈ鐒驖{、稀釋）。
接種：
液體培養(yǎng)基 (UBB)：用無菌吸管或接種環(huán)將樣品或純培養(yǎng)物接種到培養(yǎng)基中。接種后輕輕搖勻。
固體培養(yǎng)基 (UBA平板)：可用劃線法、涂布法或點(diǎn)種法接種樣品或純培養(yǎng)物。
創(chuàng)造厭氧環(huán)境：這是成功培養(yǎng)厭氧菌的關(guān)鍵步驟。
厭氧罐/罐系統(tǒng)：最常用。將接種好的試管或平板放入?yún)捬豕拗小Ｊ褂蒙虡I(yè)厭氧產(chǎn)氣袋（通常含硼氫化鈉/檸檬酸、碳酸氫鈉/檸檬酸混合物，產(chǎn)生H?和CO?）或鋼瓶通入混合氣體（如80% N?, 10% H?, 10% CO?）。H?在罐內(nèi)鈀催化劑作用下與殘余O?反應(yīng)生成水，達(dá)到厭氧狀態(tài)。罐內(nèi)放置刃天青指示條確認(rèn)厭氧狀態(tài)（無色）。
厭氧工作站（手套箱）：整個操作（接種、培養(yǎng)、觀察）都在持續(xù)通入無氧混合氣體（N?/H?/CO?）的密閉箱內(nèi)進(jìn)行，是最理想的厭氧環(huán)境。
深層瓊脂穿刺：對于UBB，接種后加入一層無菌液體石蠟或熔化的無菌瓊脂（約1-2cm厚）封住液面，隔絕氧氣。
培養(yǎng)：
溫度：通常選擇 35-37°C 培養(yǎng)，適合大多數(shù)臨床和環(huán)境厭氧菌。特定菌種可能需要不同溫度（如25-30°C或42°C）。
時間：厭氧菌生長通常較需氧菌慢。至少培養(yǎng)48小時，對于生長緩慢的菌種或從復(fù)雜樣品中初代分離，通常需要培養(yǎng)5-7天甚至更長時間（如2周）。每天或定期觀察。
觀察與判讀：
液體培養(yǎng)基 (UBB)：觀察渾濁度、沉淀、產(chǎn)氣（氣泡）、顏色變化（如指示劑）、氣味（厭氧菌常有特殊臭味）。取培養(yǎng)物涂片染色鏡檢。
固體培養(yǎng)基 (UBA平板)：觀察菌落形態(tài)（大小、形狀、邊緣、隆起度、顏色、透明度、光澤）、溶血情況（是否在血瓊脂版上產(chǎn)生溶血環(huán)）。進(jìn)行純化、染色鏡檢和生化鑒定。
三、關(guān)鍵注意事項
厭氧環(huán)境至關(guān)重要：從樣品采集、運(yùn)輸、處理到接種、培養(yǎng)，每一步都需盡可能減少暴露于空氣的時間，并使用預(yù)還原的培養(yǎng)基或快速轉(zhuǎn)移至厭氧系統(tǒng)。厭氧罐/工作站的使用和指示劑驗證是核心。
新鮮培養(yǎng)基：制備好的UBA培養(yǎng)基（尤其是液體）應(yīng)盡快使用。儲存時間過長可能導(dǎo)致氧氣滲入，Eh升高。平板可密封于厭氧袋中冷藏保存，但使用前最好在厭氧環(huán)境下放置一段時間恢復(fù)還原狀態(tài)。
延長培養(yǎng)時間：不要過早丟棄培養(yǎng)物。許多重要的厭氧菌生長緩慢。
質(zhì)量控制：使用前用已知的標(biāo)準(zhǔn)厭氧菌株和需氧菌株進(jìn)行質(zhì)控，確保UBA支持厭氧菌生長而抑制需氧菌（在厭氧條件下）。
安全防護(hù)：某些厭氧菌（如
肉毒梭菌、
破傷風(fēng)梭菌）是強(qiáng)致病菌，操作應(yīng)在相應(yīng)生物安全級別的實驗室進(jìn)行。
四、總結(jié)
UBA培養(yǎng)基的核心原理在于其豐富的營養(yǎng)成分和通過還原劑（半胱氨酸/硫乙醇酸鹽） 創(chuàng)造并維持低氧化還原電勢（Eh）的厭氧環(huán)境，滿足嚴(yán)格厭氧菌的生長需求。其成功應(yīng)用的關(guān)鍵在于嚴(yán)格的無氧操作流程（使用厭氧罐或工作站）和足夠的培養(yǎng)時間。它是分離和培養(yǎng)臨床、環(huán)境樣本中梭菌及其他厭氧菌的基礎(chǔ)培養(yǎng)基之一。
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