食品志賀氏菌檢驗方法詳解之樣品制備與增菌及生化鑒定！
小楊 / 2025-07-07 09:51:33
食品中
志賀氏菌（Shigella spp.）的檢驗是食品安全檢測的重要項目之一，因為志賀氏菌是引起細(xì)菌性痢疾的主要病原體。目前國際上和國內(nèi)主要采用的標(biāo)準(zhǔn)方法是基于選擇性增菌、分離培養(yǎng)、生化鑒定和血清學(xué)分型的傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，并結(jié)合了現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行確證。
以下是最常用的檢驗方法概述，主要參考中國國家標(biāo)準(zhǔn)和國際標(biāo)準(zhǔn)：
核心方法：選擇性增菌培養(yǎng) + 分離培養(yǎng) + 生化鑒定 + 血清學(xué)分型
一、樣品制備與增菌
1、樣品處理：
無菌操作稱取25g（或25mL）食品樣品。
放入滅菌的均質(zhì)袋或均質(zhì)瓶中。
加入225mL 志賀氏菌增菌肉湯或其他推薦的非選擇性肉湯。這是前增菌步驟，目的是讓受損的志賀氏菌細(xì)胞復(fù)蘇并開始生長，同時稀釋食品基質(zhì)中的抑制物。
充分均質(zhì)（拍打或攪拌）。
2、選擇性增菌：
將均質(zhì)液在36±1°C下培養(yǎng)16-20小時（前增菌）。
取1mL前增菌培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)種到10mL 志賀氏菌增菌肉湯（含新生霉素或其他選擇性試劑） 或 革蘭氏陰性桿菌增菌肉湯中。
在42±1°C（或36±1°C，視具體標(biāo)準(zhǔn)或增菌液要求而定）下培養(yǎng)18-24小時。此步驟利用溫度或選擇性抑制劑抑制雜菌（尤其是
變形桿菌和
大腸菌群），促進(jìn)志賀氏菌生長。
二、分離培養(yǎng)（平板劃線）
1、接種選擇性平板：
用接種環(huán)取選擇性增菌培養(yǎng)物，分別在以下兩種（或更多）選擇性/鑒別性瓊脂平板上劃線分離：
木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂：志賀氏菌通常呈現(xiàn)紅色、半透明、光滑、中心不顯黑色的菌落（不發(fā)酵木糖，不產(chǎn)H?S）。是分離志賀氏菌的首選平板之一。
麥康凱瓊脂：志賀氏菌呈現(xiàn)無色（不發(fā)酵乳糖）、半透明、光滑的菌落。
赫克通腸道菌瓊脂/沙門氏菌-志賀氏菌瓊脂：志賀氏菌落通常為綠色、半透明（不發(fā)酵乳糖，不產(chǎn)H?S）。SS對志賀氏菌有一定抑制作用，有時效果不如XLD和MAC。
志賀氏菌顯色瓊脂：利用特異性酶底物顯色，志賀氏菌通常呈現(xiàn)特定顏色（如紫色、藍(lán)綠色等，具體顏色取決于品牌配方），能有效區(qū)分志賀氏菌和其他腸道菌，特異性較高。
2、培養(yǎng)：
將平板倒置于36±1°C培養(yǎng)20-24小時。
3、菌落挑選：
觀察平板，挑取符合志賀氏菌典型形態(tài)特征的菌落（如XLD上的紅色半透明菌落，MAC上的無色菌落，顯色平板上的特定顏色菌落）。
每個平板至少挑選2-5個可疑菌落。
三、初步生化鑒定（純培養(yǎng)與基本試驗）
1、純培養(yǎng)：
將挑選的可疑菌落分別接種到營養(yǎng)瓊脂斜面或三糖鐵瓊脂（TSI） 和 賴氨酸鐵瓊脂（LIA） 上，以獲得純培養(yǎng)物用于后續(xù)試驗。
36±1°C培養(yǎng)18-24小時。
2、關(guān)鍵生化試驗（篩選試驗）：
三糖鐵瓊脂（TSI）：志賀氏菌通常表現(xiàn)為：斜面堿性（紅色）/底層酸性（黃色），不產(chǎn)氣（瓊脂不開裂或僅有小裂縫），不產(chǎn)H?S（不顯黑色）。這是與沙門氏菌（通常產(chǎn)H?S）和部分變形桿菌區(qū)分的重要指標(biāo)。
賴氨酸脫羧酶試驗（LIA或單獨(dú)試驗）：志賀氏菌通常為陰性（斜面堿性/底層酸性，不顯紫色）。有助于與部分沙門氏菌（陽性）區(qū)分。
動力試驗（半固體培養(yǎng)基）：志賀氏菌無鞭毛，無動力（僅在穿刺線生長，周圍培養(yǎng)基澄清）。這是與有動力的腸桿菌科細(xì)菌（如
大腸桿菌、
變形桿菌、
沙門氏菌等）區(qū)分的關(guān)鍵特征。
尿素酶試驗：志賀氏菌通常為陰性（不變紅）。用于排除快速尿素酶陽性的細(xì)菌（如變形桿菌屬）。
吲哚試驗：結(jié)果可變，不同種/型結(jié)果不同（宋內(nèi)氏志賀氏菌通常陽性，福氏志賀氏菌多為陰性）。
ONPG試驗（β-半乳糖苷酶）：用于檢測遲發(fā)酵乳糖的能力。宋內(nèi)氏志賀氏菌通常為陽性（黃色），其他志賀氏菌為陰性（無色）。是區(qū)分宋內(nèi)氏與其他志賀氏菌的重要試驗。
四、血清學(xué)分型（確證）
1、前提：
生化反應(yīng)符合志賀氏菌屬特征（無動力、TSI斜面堿/底層酸不產(chǎn)氣不產(chǎn)H?S、賴氨酸脫羧酶陰性、尿素酶陰性）。
2、玻片凝集試驗：
用生理鹽水制備純培養(yǎng)菌懸液。
先用志賀氏菌多價血清進(jìn)行凝集試驗。若陽性，則表明該菌株屬于志賀氏菌屬。
若多價血清凝集陽性，則進(jìn)一步用志賀氏菌單價因子血清進(jìn)行分群（A群：痢疾志賀氏菌；B群：福氏志賀氏菌；C群：鮑氏志賀氏菌；D群：宋內(nèi)氏志賀氏菌）和分型/亞型。
注意：宋內(nèi)氏志賀氏菌通常表現(xiàn)為光滑型（S）菌落，其血清凝集性較好。其他志賀氏菌（特別是福氏志賀氏菌）有時會出現(xiàn)粗糙型（R）變異，導(dǎo)致自凝或不凝集，此時需要傳代恢復(fù)其光滑型或采用其他方法（如分子方法）確認(rèn)。
自凝檢查：菌懸液在生理鹽水中應(yīng)均勻混濁，無自凝現(xiàn)象。若有自凝，則血清凝集結(jié)果不可靠。
五、分子生物學(xué)確證（可選/補(bǔ)充）
PCR檢測：針對
志賀氏菌屬特異性基因或種/型特異性基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。ipaH基因是常用的靶標(biāo)，它存在于志賀氏菌和侵襲性大腸桿菌（EIEC）的染色體和毒力質(zhì)粒上，拷貝數(shù)多，靈敏度高，特別適合從增菌液或可疑菌落中快速篩查和確證。
實時熒光定量PCR（qPCR）：更快速、靈敏，可用于定量或直接檢測樣品/增菌液。
優(yōu)點(diǎn)：快速（數(shù)小時）、特異性高，尤其適用于生化反應(yīng)不典型或血清學(xué)凝集不佳的菌株的確證，以及從復(fù)雜背景中直接檢測。
注意：PCR陽性結(jié)果通常需要結(jié)合培養(yǎng)結(jié)果來判斷活菌存在，并且不能替代血清學(xué)分型。
六、報告結(jié)果
根據(jù)生化鑒定和血清學(xué)分型結(jié)果，報告樣品中是否檢出
志賀氏菌。
若檢出，應(yīng)報告其血清群和血清型（如福氏志賀氏菌2a型、宋內(nèi)氏志賀氏菌等）。
若使用了分子方法確證，也應(yīng)注明。
重要注意事項：
生物安全：
志賀氏菌屬于生物安全三級病原體！所有實驗操作必須在具備相應(yīng)生物安全防護(hù)條件的實驗室（II級或III級生物安全柜）中進(jìn)行，操作人員需經(jīng)過嚴(yán)格培訓(xùn)并遵守生物安全規(guī)范。廢棄物必須高壓滅菌處理。
志賀氏菌的脆弱性：志賀氏菌對干燥、酸和低溫敏感，樣品處理和運(yùn)輸需及時、低溫（通常0-4°C，但不宜冷凍）。
與EIEC的區(qū)分：侵襲性大腸桿菌（EIEC）在生化特性、致病機(jī)制和臨床癥狀上與志賀氏菌非常相似，血清學(xué)也可能有交叉。最終區(qū)分通常需要依賴毒力基因檢測或更復(fù)雜的生化組合試驗（如乙酸鈉利用、粘液酸發(fā)酵等）。
方法的局限性：傳統(tǒng)培養(yǎng)法耗時較長（通常需要4-5天或更長）。食品基質(zhì)復(fù)雜，存在背景菌群競爭和抑制物，可能導(dǎo)致假陰性。分子方法雖快，但可能檢出死菌或無法提供活菌信息及血清型。
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