凝結(jié)芽孢桿菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的原理與使用方法及操作步驟！
小楊 / 2025-07-05 09:52:05
凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）計(jì)數(shù)通常使用特定的選擇性培養(yǎng)基，最常用的是 TSC 培養(yǎng)基或其改良版本。該培養(yǎng)基的原理在于利用目標(biāo)菌的生理特性（特別是其芽孢的耐熱性和代謝特性）來抑制雜菌并促進(jìn)目標(biāo)菌生長。
一、原理
芽孢耐熱性：凝結(jié)芽孢桿菌能形成耐熱的芽孢。樣品經(jīng)過適當(dāng)?shù)臒崽幚恚ㄈ?80°C 或 85°C 水?。┛梢詺⑺罉悠分薪^大多數(shù)的營養(yǎng)細(xì)胞（包括其他非芽孢菌和部分不耐熱的芽孢菌），而凝結(jié)芽孢桿菌的芽孢能存活下來。
亞硫酸鹽還原能力：凝結(jié)芽孢桿菌在厭氧條件下生長時(shí)，能將培養(yǎng)基中的亞硫酸鹽還原成硫化物。
黑色沉淀形成：產(chǎn)生的硫化物與培養(yǎng)基中的鐵鹽反應(yīng)，生成不溶性的黑色硫化亞鐵（FeS）沉淀。這是識別目標(biāo)菌落最關(guān)鍵的標(biāo)志。
選擇性抑制：
D-環(huán)絲氨酸（D-Cycloserine）：這是TSC培養(yǎng)基的核心選擇性成分。它是一種抗生素，能有效抑制絕大多數(shù)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌（包括其他常見的芽孢桿菌如
蠟樣芽孢桿菌）的營養(yǎng)細(xì)胞生長。但凝結(jié)芽孢桿菌的芽孢對D-環(huán)絲氨酸具有相對抗性，能在其存在下萌發(fā)并生長。
亞硫酸鹽：除了作為指示系統(tǒng)的底物外，一定濃度的亞硫酸鹽對部分雜菌也有一定的抑制作用。
熱處理：如前所述，預(yù)先熱處理樣品是極其重要的一步選擇性措施，極大地降低了背景雜菌的數(shù)量。
總結(jié)原理：通過熱處理殺死營養(yǎng)細(xì)胞，利用D-環(huán)絲氨酸選擇性抑制絕大多數(shù)殘留或可能污染的雜菌（尤其是其他芽孢桿菌），在厭氧條件下培養(yǎng)后，凝結(jié)芽孢桿菌的芽孢萌發(fā)、生長，并通過還原亞硫酸鹽產(chǎn)生黑色硫化亞鐵沉淀，形成特征性的黑色菌落（通常帶有黑色暈環(huán)或整個(gè)菌落變黑），從而進(jìn)行計(jì)數(shù)。
二、使用方法 (基于 GB 4789.14-2014 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 蠟樣芽孢桿菌檢驗(yàn) 附錄B 凝結(jié)芽孢桿菌的計(jì)數(shù))
重要提示：具體操作請務(wù)必遵循你所執(zhí)行的最新版本國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)或藥典規(guī)定。細(xì)節(jié)（如稀釋液、熱處理溫度/時(shí)間、培養(yǎng)時(shí)間）可能因標(biāo)準(zhǔn)更新或具體應(yīng)用（食品、藥品、益生菌產(chǎn)品）而略有不同。
主要材料與試劑
TSC 培養(yǎng)基基礎(chǔ)：含胰酪胨、大豆胨、酵母浸粉、亞硫酸鈉、檸檬酸鐵銨等。
D-環(huán)絲氨酸溶液：按標(biāo)準(zhǔn)要求濃度配制（通常終濃度為400mg/L）。
無菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液：用于樣品稀釋。
無菌平皿、移液管/移液器及槍頭、均質(zhì)袋/均質(zhì)杯、水浴鍋、厭氧培養(yǎng)裝置（如厭氧罐/袋+產(chǎn)氣包）、恒溫培養(yǎng)箱等。
操作步驟
樣品制備與稀釋：
無菌稱取或量取一定量（通常25g或25mL）樣品。
加入適量的無菌稀釋液，在均質(zhì)器中充分均質(zhì)1-2分鐘，制成1:10的樣品勻液。
用無菌移液管或移液器吸取1:10勻液1mL，加入9mL無菌稀釋液中，充分混勻，制成1:100的稀釋液。
按此方法，根據(jù)需要制備一系列十倍遞增稀釋度。選擇2-3個(gè)適宜稀釋度進(jìn)行后續(xù)操作。
熱處理 (關(guān)鍵步驟)：
將每個(gè)選定的稀釋度樣品勻液（注意：是稀釋后的勻液，不是原始樣品）置于80°C ± 1°C 或 85°C ± 1°C（具體溫度依據(jù)所執(zhí)行的標(biāo)準(zhǔn)）的水浴中。
精確計(jì)時(shí)加熱 10分鐘。此步驟殺死營養(yǎng)細(xì)胞，保留凝結(jié)芽孢桿菌芽孢。
立即將處理后的樣品勻液冷卻至室溫（如置于冰水浴中）。
傾注平板：
無菌操作，吸取熱處理并冷卻后的各稀釋度樣品勻液1mL，分別加入無菌平皿中。
傾注TSC培養(yǎng)基：
將制備好的TSC基礎(chǔ)培養(yǎng)基融化并冷卻至45-50°C。
臨用前，按標(biāo)準(zhǔn)要求加入適量過濾除菌的D-環(huán)絲氨酸溶液，輕輕搖勻（避免產(chǎn)生氣泡）。
立即將約15-20mL含D-環(huán)絲氨酸的TSC培養(yǎng)基傾注于每個(gè)已加入樣液的平皿中。
小心旋轉(zhuǎn)平皿，使樣液與培養(yǎng)基充分混勻，避免產(chǎn)生氣泡。靜置待其凝固。
厭氧培養(yǎng)：
待瓊脂完全凝固后，將平板倒置。
放入?yún)捬跖囵B(yǎng)裝置（如厭氧罐或厭氧袋）中。
按照厭氧裝置的要求（通常是加入產(chǎn)氣袋或使用氣體置換法）創(chuàng)造厭氧環(huán)境。
將厭氧裝置置于 36°C ± 1°C 的恒溫培養(yǎng)箱中。
培養(yǎng) 48小時(shí) ± 2小時(shí)。
菌落計(jì)數(shù)：
培養(yǎng)結(jié)束后，取出平板。
選擇菌落數(shù)在15-150 CFU之間的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)（若所有稀釋度均小于15，則記錄最低稀釋度的菌落數(shù)；若所有稀釋度均大于150，則記錄最高稀釋度的菌落數(shù)或記為“多不可計(jì)”）。
目標(biāo)菌落特征：凝結(jié)芽孢桿菌在TSC培養(yǎng)基上呈現(xiàn)黑色或棕黑色菌落，菌落周圍通常有黑色沉淀環(huán)（暈環(huán)），有時(shí)整個(gè)菌落呈黑色。這是基于其還原亞硫酸鹽產(chǎn)生FeS沉淀的特性。
注意：計(jì)數(shù)時(shí)，只計(jì)數(shù)符合上述典型特征的黑色（帶暈環(huán)）菌落。非黑色的菌落通常是雜菌或非目標(biāo)菌，不應(yīng)計(jì)數(shù)。
結(jié)果計(jì)算與報(bào)告：
根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果和相應(yīng)的稀釋倍數(shù)，計(jì)算每克（或每毫升）樣品中凝結(jié)芽孢桿菌的數(shù)量（CFU/g 或 CFU/mL）。
報(bào)告結(jié)果時(shí)，通常以科學(xué)計(jì)數(shù)法表示（如 1.5 × 10? CFU/g）。
三、關(guān)鍵注意事項(xiàng)
標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)：嚴(yán)格遵循你所執(zhí)行的最新有效標(biāo)準(zhǔn)。溫度、時(shí)間、培養(yǎng)基配方、D-環(huán)絲氨酸濃度等細(xì)節(jié)都可能隨標(biāo)準(zhǔn)更新而變化。
熱處理：溫度（80°C 或 85°C）和時(shí)間（10分鐘）必須精確控制。溫度過低或時(shí)間過短無法有效殺死營養(yǎng)細(xì)胞；溫度過高或時(shí)間過長可能損傷甚至殺死目標(biāo)芽孢。水浴鍋溫度需校準(zhǔn)。
D-環(huán)絲氨酸：必須過濾除菌，并在傾注培養(yǎng)基前臨用加入。其濃度對選擇性至關(guān)重要。
厭氧培養(yǎng)：確保厭氧裝置密封良好且產(chǎn)氣正常，創(chuàng)造有效的厭氧環(huán)境是目標(biāo)菌落產(chǎn)生黑色沉淀的必要條件。
培養(yǎng)基溫度：傾注時(shí)培養(yǎng)基溫度不能過高（>50°C可能燙傷芽孢），也不能過低（<45°C可能提前凝固，混合不均）。
菌落識別：準(zhǔn)確識別典型黑色帶暈環(huán)的菌落是正確計(jì)數(shù)的關(guān)鍵。需由有經(jīng)驗(yàn)的人員進(jìn)行操作或進(jìn)行菌落確證。
無菌操作：整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)程，防止污染。
平行試驗(yàn)：通常每個(gè)稀釋度做兩個(gè)或三個(gè)平行平板，以提高結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。
培養(yǎng)基質(zhì)量控制：使用前應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基的質(zhì)量控制，確保其支持目標(biāo)菌生長并抑制雜菌。
通過嚴(yán)格遵循TSC培養(yǎng)基的原理和標(biāo)準(zhǔn)化的使用方法，可以相對準(zhǔn)確地定量檢測樣品（特別是食品、益生菌制品等）中凝結(jié)芽孢桿菌的數(shù)量。
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