培養(yǎng)基與培養(yǎng)時間對細(xì)菌總數(shù)檢測的具體影響有哪些？
小楊 / 2025-06-23 10:07:41
百歐博偉生物：檢測水體中的細(xì)菌總數(shù)（通常指異養(yǎng)菌平板計數(shù)）是評價水質(zhì)衛(wèi)生狀況和微生物污染程度的重要指標(biāo)。培養(yǎng)基和培養(yǎng)時間是影響檢測結(jié)果準(zhǔn)確性和可比性的兩個最關(guān)鍵的因素。以下是它們的具體影響：
一、培養(yǎng)基的影響
1、營養(yǎng)成分與豐富度：
高營養(yǎng)培養(yǎng)基（如營養(yǎng)瓊脂/肉膏瓊脂）：更適合富營養(yǎng)環(huán)境中的細(xì)菌或生長快速的細(xì)菌。使用這類培養(yǎng)基可能導(dǎo)致：
低估貧營養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量：許多水體中的原生細(xì)菌（特別是清潔水源中的）是貧營養(yǎng)型或寡營養(yǎng)型，它們在營養(yǎng)過于豐富的培養(yǎng)基上可能生長緩慢、不生長甚至死亡（營養(yǎng)休克）。
高估可培養(yǎng)菌數(shù)？：在污染水體中，可能促進(jìn)某些快速生長的細(xì)菌過度繁殖，形成更大菌落，但未必能更全面地反映所有可培養(yǎng)菌。
低營養(yǎng)培養(yǎng)基：專門設(shè)計用于培養(yǎng)水體等環(huán)境樣本中的貧營養(yǎng)細(xì)菌。它們通常含有較低濃度的碳源、氮源和微量元素，更接近自然環(huán)境條件。使用這類培養(yǎng)基通常：
獲得更高的菌落計數(shù)：因為它能支持更多種類的貧營養(yǎng)細(xì)菌生長，更真實地反映水體中可培養(yǎng)的異養(yǎng)菌總數(shù)。
菌落更小、生長更慢：需要更長的培養(yǎng)時間才能形成可見菌落。
2、選擇性：
不同培養(yǎng)基的配方（碳源、氮源、維生素、生長因子、緩沖鹽、抑制劑等）決定了它能支持哪些類群的細(xì)菌生長。
沒有一種“萬能”培養(yǎng)基能培養(yǎng)出所有細(xì)菌。水體中通常包含多種生理類型（貧營養(yǎng)、富營養(yǎng)、嗜冷、嗜溫、需氧、兼性厭氧等）的細(xì)菌。
選擇不同的培養(yǎng)基，必然會導(dǎo)致最終計數(shù)的細(xì)菌類群和數(shù)量不同。例如，含鹽培養(yǎng)基會抑制非嗜鹽菌，而含特定抗生素的培養(yǎng)基會選擇性抑制某些細(xì)菌。
3、pH 和滲透壓：
培養(yǎng)基的初始pH和滲透壓會影響細(xì)菌的復(fù)蘇和生長。偏離細(xì)菌最適范圍會抑制其生長，導(dǎo)致計數(shù)偏低。
4、瓊脂濃度：
影響培養(yǎng)基的硬度，進(jìn)而影響菌落的擴散性。濃度過低可能導(dǎo)致菌落蔓延，難以計數(shù)。
結(jié)論：培養(yǎng)基的選擇直接決定了實驗中“可培養(yǎng)”的細(xì)菌范圍。 使用高營養(yǎng)培養(yǎng)基會嚴(yán)重低估清潔水體中的細(xì)菌總數(shù)，而低營養(yǎng)培養(yǎng)基是當(dāng)前國際推薦用于飲用水和較清潔水體HPC檢測的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基，能提供更接近實際可培養(yǎng)菌數(shù)的結(jié)果。對于污染嚴(yán)重的水體，營養(yǎng)瓊脂也可能適用，但結(jié)果不可與使用R2A的結(jié)果直接比較。
二、培養(yǎng)時間的影響
1、細(xì)菌生長速度的差異：
水體中的細(xì)菌種類繁多，其世代時間（分裂一次所需時間）差異巨大。有些細(xì)菌在適宜條件下幾十分鐘就能分裂一次（快生菌），而貧營養(yǎng)菌或受傷的細(xì)菌可能需要幾天甚至幾周才能形成可見菌落（慢生菌）。
固定的短培養(yǎng)時間（如24或48小時）只能計數(shù)生長最快的細(xì)菌。
2、菌落形成所需時間：
單個細(xì)菌細(xì)胞或小菌團需要經(jīng)歷復(fù)蘇、適應(yīng)、生長和分裂多個階段，才能增殖到肉眼可見的大小（通常>0.1 mm）。
貧營養(yǎng)菌、受傷菌或處于休眠狀態(tài)的細(xì)胞，這個適應(yīng)和啟動生長的過程可能非常長。
3、對計數(shù)結(jié)果的直接影響：
培養(yǎng)時間過短（如24-48小時）：
嚴(yán)重低估總菌數(shù)：絕大多數(shù)貧營養(yǎng)菌和許多生長較慢的細(xì)菌無法形成可見菌落。
結(jié)果主要反映快速生長的富營養(yǎng)細(xì)菌。
延長培養(yǎng)時間（如5天、7天甚至更長）：
顯著提高計數(shù)結(jié)果：越來越多的慢生菌有足夠時間形成菌落。
更全面地反映可培養(yǎng)菌群：更接近水體中實際可復(fù)蘇和培養(yǎng)的細(xì)菌總數(shù)。
可能引入新問題：
蔓延菌落：某些細(xì)菌在長時間培養(yǎng)后會擴散生長，覆蓋其他菌落或整個平板，導(dǎo)致無法準(zhǔn)確計數(shù)。
菌落融合：相鄰菌落長時間生長可能融合在一起，被計為一個菌落。
培養(yǎng)基干燥：長時間培養(yǎng)可能導(dǎo)致平板失水干燥，影響后續(xù)細(xì)菌生長甚至導(dǎo)致菌落死亡。
次生代謝影響：先長出的菌落可能產(chǎn)生抗菌物質(zhì)抑制周圍菌落生長。
結(jié)論：培養(yǎng)時間不足是導(dǎo)致HPC計數(shù)嚴(yán)重低估（尤其是清潔水體）的最主要原因之一。延長培養(yǎng)時間對于獲得更準(zhǔn)確的總數(shù)至關(guān)重要。
三、標(biāo)準(zhǔn)方法中的折衷
考慮到實際操作（時效性、防止蔓延等）和結(jié)果的穩(wěn)定性，標(biāo)準(zhǔn)方法通常會規(guī)定一個折衷的培養(yǎng)時間。
例如：
使用營養(yǎng)瓊脂（NA）時，標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)時間常為 48 ± 3小時 (35-37°C)。
使用低營養(yǎng)培養(yǎng)基時，推薦培養(yǎng)時間顯著延長。例如：
美國標(biāo)準(zhǔn)方法：R2A瓊脂，5-7天，28°C。
中國《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法》（GB/T 5750.12）：R2A瓊脂， 培養(yǎng)7天 (28°C 或 36°C ±1°C)。
這種延長時間（5-7天）是為了最大程度地捕獲水體中生長緩慢的貧營養(yǎng)菌，同時盡量避免因時間過長帶來的蔓延等問題。
四、總結(jié)與關(guān)鍵點
相互作用：培養(yǎng)基和培養(yǎng)時間是緊密關(guān)聯(lián)的。低營養(yǎng)培養(yǎng)基通常需要更長的培養(yǎng)時間才能獲得有意義的計數(shù)。
低估是常態(tài)：無論選擇何種培養(yǎng)基和培養(yǎng)時間，平板計數(shù)法都只能檢測到能在所選條件下生長并形成菌落的那部分細(xì)菌（可培養(yǎng)的異養(yǎng)菌），通常只占環(huán)境樣品中總細(xì)菌（通過顯微鏡直接計數(shù)）的極小一部分（<1%）。培養(yǎng)基和培養(yǎng)時間的選擇主要影響這個“可培養(yǎng)部分”的檢出比例和組成。
標(biāo)準(zhǔn)化的必要性：為了結(jié)果的可比性（不同實驗室間、不同時間點），必須嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)方法規(guī)定的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件（溫度、時間）進(jìn)行操作。使用不同的培養(yǎng)基或改變培養(yǎng)時間，得到的結(jié)果絕對不可直接比較。
培養(yǎng)基選擇優(yōu)先：對于飲用水及較清潔水體，使用低營養(yǎng)培養(yǎng)基是獲得更準(zhǔn)確、更高HPC計數(shù)的前提。
培養(yǎng)時間關(guān)鍵：在選擇了合適的低營養(yǎng)培養(yǎng)基后，保證足夠的培養(yǎng)時間（通常5-7天）是準(zhǔn)確計數(shù)（尤其是包含貧營養(yǎng)菌）的關(guān)鍵。縮短時間會嚴(yán)重低估。
因此，在設(shè)計或解讀水體細(xì)菌總數(shù)（HPC）檢測結(jié)果時，必須明確標(biāo)注所使用的具體培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件（溫度和時間），否則結(jié)果將失去可比性和實際意義。選擇合適的培養(yǎng)基（推薦低營養(yǎng)）并給予足夠長的培養(yǎng)時間（5-7天），是盡可能接近真實“可培養(yǎng)異養(yǎng)菌總數(shù)”的必要條件。
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