山梨醇（乳酸菌）發(fā)酵試驗的原理與方法及操作步驟！
小楊 / 2025-06-07 09:39:19
一、實驗原理
1、培養(yǎng)基組成與功能
碳源與生長因子：蛋白胨、牛肉浸粉、酵母浸粉提供基礎(chǔ)營養(yǎng)；吐溫80為乳酸菌提供必需生長因子，優(yōu)化其生長環(huán)境。
凝固劑：少量瓊脂（1.5 g/L）防止氣體擴散，維持厭氧條件。
指示系統(tǒng)：溴甲酚紫（1.4 ml/ L）作為pH指示劑，發(fā)酵產(chǎn)酸時由紫色變黃色（陽性），無變化則保持紫色（陰性）。
發(fā)酵底物：山梨醇（5 g/L）為唯一可發(fā)酵糖源，菌株代謝能力決定顏色變化。
2、代謝機制
二、標準操作步驟
1、培養(yǎng)基配制
按以下配方制備（以1L為例）：
成分 用量
蛋白胨 5.0 g
牛肉浸粉 5.0 g
酵母浸粉 5.0 g
吐溫80 0.5 ml
瓊脂 1.5 g
山梨醇 5.0 g
1.6%溴甲酚紫酒精溶液 1.4 ml
pH 7.4±0.2（25℃）
2、實驗流程
（1）菌懸液制備：
從純培養(yǎng)物中挑取單菌落，用生理鹽水稀釋至0.5麥氏濁度（約10? CFU/ml）。
（2）接種與培養(yǎng)：
吸取0.05 ml菌懸液加入含培養(yǎng)基的安瓿瓶或試管中。
36±1℃厭氧培養(yǎng)18-24小時。
（3）結(jié)果判讀：
陽性：培養(yǎng)基整體變黃（山梨醇發(fā)酵產(chǎn)酸）。
陰性：保持紫色或藍綠色（無發(fā)酵能力）。
三、質(zhì)量控制與結(jié)果解釋
質(zhì)控菌株示例：
菌種 結(jié)果 現(xiàn)象
植物乳桿菌 陽性 培養(yǎng)基變黃
瑞士乳桿菌 陰性 培養(yǎng)基紫色不變
注意事項：
需結(jié)合其他生化試驗（如糖發(fā)酵譜、VP試驗）綜合鑒定菌種，避免假陽性/陰性。
培養(yǎng)時間超過24小時可能導致弱陽性菌株變色，需嚴格控時。
四、應(yīng)用場景
1、乳酸菌鑒定：
2、病原菌研究：
山梨醇代謝能力與致病性相關(guān)。例如：
艱難梭菌譜系利用宿主山梨醇增殖，加重炎癥性腸病（IBD）患者感染；限制山梨醇攝入可降低感染風險。
3、工業(yè)發(fā)酵優(yōu)化：
調(diào)控山梨醇濃度（最高至38%）可提升山梨糖產(chǎn)量（達360 mg/mL），用于維生素C生產(chǎn)。
添加乳酸菌（如植物乳桿菌）改善青貯飼料品質(zhì)，提升乳酸含量84.6%，降低氨態(tài)氮38.5%。
五、注意事項與常見問題
1、假陰性風險：
接種菌量不足或培養(yǎng)溫度偏差可能導致結(jié)果異常，需嚴格遵循濁度與溫度參數(shù)。
2、指示劑失效：
溴甲酚紫遇光易降解，培養(yǎng)基應(yīng)避光保存，有效期通常為1年（常溫/冷藏）。
3、擴展應(yīng)用：
非培養(yǎng)狀態(tài)的乳酸菌可抑制后酸化，延長發(fā)酵食品貨架期。
附：流程圖快速指南
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此試驗是乳酸菌分類的核心方法，結(jié)合代謝機制與工業(yè)場景，可為菌種篩選、致病機制研究及生產(chǎn)工藝優(yōu)化提供關(guān)鍵依據(jù)。
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