細(xì)胞培養(yǎng)支原體檢測——直接培養(yǎng)法
中國微生物菌種查詢網(wǎng) / 2016-01-14 16:36:50
細(xì)胞培養(yǎng)支原體檢測——直接培養(yǎng)法
· 原理：直接培養(yǎng)支原體于培養(yǎng)基中，觀察其生長及菌落生成
· 特點(diǎn)：是目最直接與靈敏之步驟，亦是用來評估其它偵測新步驟之標(biāo)準(zhǔn)步驟。
· 缺點(diǎn)：培養(yǎng)時間長，須3－5星期才能判斷。有些支原體不能在培養(yǎng)基培養(yǎng)出來 (例如M. hyorhinis)。需同時培養(yǎng)支原體株作正反應(yīng)對照組，可能會造成污染。
· 材枓：dextrose、L-arginine HCl、Difco PPLO broth (Difco 0554-17-1) horseserum、15% yeast extract solution (autoclaved)、Bactoagar、無菌有蓋螺旋試管(autoclaved)、無菌培養(yǎng)皿﹙60x15mm﹚、L-玻棒、37℃培養(yǎng)箱、厭氧缸（厭氧缸長期培養(yǎng)易有污染，所以厭氧包應(yīng)用無菌水，每次打開厭氧缸后，用70% ethanol擦拭內(nèi)壁。）
· 培養(yǎng)基制備：基本配方為Difco PPLObroth(60%), 馬血清(20%), 15% yeast extreat solution (10%), 10x stocksolution (10%)。由于培養(yǎng)時間長，可加入penicillin(50u/ml)至10x stocksolution或加入thallium acetate (1：2000)至培養(yǎng)基中以防止其它細(xì)菌污染。
· 10x stock solution (1 liter) ：稱取50 g dextrose，10 g L-arginine HCl，溶于1 liter蒸餾水中。以0.22μm無菌過濾膜過濾滅菌。分裝100 ml至瓶中，保存于 -70℃。
· 液體培養(yǎng)基 (1 liter) ：稱取21 g之Difco PPLO broth，0.02 g phenol red于600ml蒸餾水中，加熱攪拌溶解之。滅菌121℃，15分鐘。待溫度降低至室溫后，于無菌操作臺內(nèi)加入200ml馬血清，100ml之15%yeast extract solution，及100ml解涷之10x stocksolution，混合均勻后，分裝至已滅菌之有蓋螺旋試管中，10ml/管。保存于4℃，期限1月。
· 固體培養(yǎng)基 (1 liter )：稱取21 g之Difco PPLO broth，0.02 g phenol red，15g Bactoagar于600ml蒸餾水中，加熱溶解之。滅菌121℃，15分鐘。放在50℃水中浴中，待溫度降低至50℃時，于無菌操作臺內(nèi)加入200ml馬血清，100ml之15% yeast extract solution 及100ml解凍之10x stocksolution，混合均勻后，倒入60x50㎜之無菌培養(yǎng)皿中，5ml/培養(yǎng)皿。保存于4℃，期限1個月。
步驟：
· 取1 ml細(xì)胞培養(yǎng)液或0.2ml細(xì)胞懸浮液，接于液體培養(yǎng)基中，置于37℃培養(yǎng)二周，觀察是否有混濁或是pH值改變之情形。培養(yǎng)周及二周后，分別取0.1 ml液體培養(yǎng)液涂在agar plate上，將其倒放置于37℃厭氧箱培養(yǎng)，培養(yǎng)至少3星期，持續(xù)觀察是否有支原體之菌落出現(xiàn)。
· 另取1 ml細(xì)胞培養(yǎng)液或0.2ml細(xì)胞懸浮液，涂抹在agar plate上，37℃厭氧培養(yǎng)3星期，持續(xù)觀察是否支原體菌落出現(xiàn)。
· 另作正負(fù)反應(yīng)對照組，正反應(yīng)對照組為Acholeplasma laidlawii (ATCC 23206) 與M. arginini (ATCC 23838)。負(fù)反應(yīng)對照組為待測細(xì)胞之新鮮培養(yǎng)基。
結(jié)果判讀：
· 支原體生長較慢，所以先在液體培養(yǎng)基培養(yǎng)1~2周增殖后，再培養(yǎng)于agar plate上。需至少培養(yǎng)3星期后，才可斷定是否有支原體污染。所以整個測試需5個星期才知正確結(jié)果。
· 典型之支原體菌落類似荷包蛋(fried- egg like)，乃是由于支原體往agar下層生長所致，為圓形無色透明菌落，小約10-55μm。但是并非所有的支原體皆為似荷包蛋菌落，有些是圓形菌落或是類似粘菌類形態(tài)（slime）。
· 若要區(qū)分細(xì)胞或是氣泡造成的類似菌落，可將其自agar plate上切下，重新培養(yǎng)于液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)一星期后再種入agar plate，若是細(xì)胞則不會生長。
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